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目的:研究CVB3 VP1蛋白与宿主蛋白MAT1的相互作用对细胞功能的影响,并通过检测细胞周期素(Cyclin D1、Cyclin E1等),细胞周期素依赖性激酶(CDK4、CDK2等),细胞周期抑制基因p21以及视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb的表达水平,探讨VP1将Hela细胞阻滞于G1/S期的分子机制,为研究CVB3的致病机制奠定基础。方法:1.采用PCR技术扩增出VP1-D8(3044-3319bp)和VP1-D4(2459-2926bp,阴性对照)基因,将其克隆至真核表达质粒p Bud CE4.1中,构建真核表达质粒p Bud CE4.1-VP1-D4和p Bud CE4.1-VP1-D8,双酶切鉴定并DNA测序验证。2.运用免疫印迹技术,检测质粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1空质粒对Hela细胞MAT1表达量的影响。3.利用流式细胞仪分析以上四种质粒对Hela细胞周期的影响。4.Quantative Real-Time RT-PCR检测以上四种质粒转染Hela细胞24 h后,细胞周期G1期检查点基因:CDK4、Cyclin D1、CDK2、Cyclin E1、CDC25A、p21的m RNA表达情况。5.Quantative Real-Time RT-PCR检测CVB3感染Hela细胞3 h、6 h、9 h后,细胞周期G1期检查点基因m RNA表达水平。6.运用免疫印迹技术,检测以上四种质粒转染Hela细胞24 h后,非磷酸化Rb、p-Rb Ser795、p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811的表达情况。结果:1.重组质粒双酶切及DNA测序结果显示p Bud CE4.1-VP1-D4和p Bud CE4.1-VP1-D8构建成功;2.质粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1空质粒转染Hela细胞24 h后,Western blot检测结果表明p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8转染组MAT1表达量较p Bud CE4.1-VP1-D4、p Bud CE4.1空质粒转染组明显下降,差异有统计学意义;3.质粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1空质粒转染Hela细胞24 h后,经流式检测细胞周期,结果表明p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8转染组G1期细胞数明显高于p Bud CE4.1-VP1-D4、p Bud CE4.1空质粒转染组,差异有统计学意义;4.质粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1转染Hela细胞24 h后,Quantative Real-Time RT-PCR结果显示:CDK4、CDK2、Cyclin D1在p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8转染组的表达量明显低于p Bud CE4.1-VP1-D4、p Bud CE4.1空质粒转染组,而p21呈相反的结果,差异均具有统计学意义;CDC25A、Cyclin E1在四个转染组均无明显变化;5.CVB3感染Hela细胞3 h、6 h、9 h后,Quantative Real-Time RT-PCR结果显示:CDK4、Cyclin D1、CDK2的表达量在CVB3感染Hela细胞3 h下降明显;p21的表达量随CVB3感染时间的延长逐渐升高,差异有统计学意义;6.质粒p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8、p Bud CE4.1-VP1-D4以及p Bud CE4.1转染Hela细胞24 h后,Western blot检测结果表明:p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811在p Bud CE4.1-VP1、p Bud CE4.1-VP1-D8转染组的表达量明显低于p Bud CE4.1-VP1-D4、p Bud CE4.1空质粒转染组,而非磷酸化Rb呈相反的结果,差异均有统计学意义;p-Rb Ser-795位点的磷酸化水平在四个转染组均无明显变化。结论:本论文提示:1.CVB3感染细胞后,通过VP1-D8与MAT1蛋白相互作用引起MAT1表达下调,导致CAK活性降低,而活性减弱的CAK使得CDK4、Cyclin D1、CDK2等基因表达下调,同时,使得p21基因的表达增加;2.CDK4、CDK2表达下调导致p-Rb Ser780和p-Rb Ser807/811位点的磷酸化水平下降,相应的非磷酸化Rb的表达升高,引起G1-S期的必需基因无法转录,最终使细胞阻滞于G1期。