我国柑橘产业发展迅猛,已成为世界第二大柑橘生产国。然而长期以来,我国柑橘品种早、中、晚熟熟期搭配不合理、晚熟品种偏少的问题一直未能得到有效的解决,国产柑橘每年有半年的空档期,国外则乘虚而入,逐渐占领柑橘类水果的高端市场。因此,如何实现国产柑橘鲜果周年均衡供应颇为重要。岩溪晚芦(Citrus reticulata)是我国从普通椪柑选出的晚熟变异品种,相同条件下,其成熟期比普通椪柑迟40-60天,果实品质优良,耐寒性较强。岩溪晚芦果实成熟过程中,果皮和果肉必然有着各自不同的内在作用机理,受其自身一系列基因的表达与调控作用。有效发掘与其外观和内质相关的优异基因具有十分重要的意义。本研究以椪柑成熟果皮为材料,利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractivehvbridization,SSH),富集椪柑果皮和果肉的差异表达基因,构建了岩溪晚芦果皮与果肉的差减cDNA文库,通过对文库筛选、克隆测序和功能分析,发掘与其外观和内质相关的优异基因,以便为今后进一步的基因功能分析、全长基因克隆及基因改造等研究打下基础。分别以成熟椪柑果肉作为抑制性差减文库的实验材料(Driver)、以成熟果皮作为抑制性差减文库的材料(Tester),采用自行改进的LiCl沉淀法,分别提取以上两种材料的总RNA,按照Oligotex mRNA Mini Kit试剂盒操作分离纯化mRNA,获得了高质量的mRNA。采用SSH试剂盒操作方法进行抑制性差减杂交,先将两种材料mRNA进行反转录成双链cDNA,经RsaⅠ酶切,再将Tester酶切产物分成两份:一份与Adoptor1连接,另一份与Adoptor2R连接;将抑制性差减杂交第二次PCR的产物纯化后连接至pTZ57R/T载体中,转化到DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选、培养,用T/A克隆法,DH5α为受体菌,菌斑经统计共9784个,其中蓝斑87个,差减文库重组率达99.1%。构建了库容量为1019个克隆的差减cDNA文库。随机对文库中100个白色克隆抽提质粒后检测,有96个阳性克隆均能检测到明显的条带,插入片段长度集中在100～500bp,与预期插入片段相一致。随机挑选了770个克隆进行测序,成功测出411个EST,其中有377个与已知基因具有较高的相似性,它们分属126个基因,其中1个基因出现频率最高达31次,为假想的一种蛋白;1个基因出现频率达28次,为未命名的蛋白产物;1个基因出现频率达25次,为假想的叶绿体RF1;5个基因出现频率在10～20之间;55个基因出现频率在2～10之间,其中大部分集中在2～5之间;63个基因只出现1次。文库中,低拷贝基因和高拷贝基因同时存在。这些基因涉及到了色素合成、能量代谢、初级代谢、次生代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化(衰老)、精油代谢、抗氧化代谢、涩味消失以及结构、运动、基因表达等等生理生化过程,大多均为果皮组织特异表达基因。另外还有涉及到涩味变化、三价铁螯合物、反转录转座子gag蛋白、查尔酮、硼离子转运、儿茶酚氧位甲基转移酶等功能的基因。功能已知且不重复的EST共有63个,占总数的49.2%。此外有5个基因共62个克隆虽在Blast搜索时找到了较高的序列同源性,但目前尚未明确功能。有待于进一步深入分析。Blast检索结果显示,另有34个基因功能未知。通过分析说明,本实验初步达到了差减特异表达基因的目的。