目的:运用CRISPR/Cas9技术,针对癌细胞系中特异的基因突变进行识别和编辑,以便向癌细胞的特定突变位点插入外源抗原表位肽序列,使外源表位肽在癌细胞中表达并呈递以诱导免疫应答。方法:选用肿瘤细胞中常见的突变基因TP53,以TP53基因CDS区突变为目标区域。以RT-PCR的测序产物筛选HEK-293、HEK293-T、K562、Jurkat、HeLa、SW480细胞系的突变。使用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具设计sgRNA核心序列构建pX458靶向编辑质粒。运用电穿孔转染的方法对3个具有突变的细胞进行靶向编辑,摸索适宜悬浮细胞的电穿孔转染方法并得到靶向编辑质粒的编辑率。另外,我们还通过:(1)向设计的sgRNA序列切割位点旁,人为引入1核苷酸的错配;(2)用靶向A细胞的编辑质粒,转染不带有A细胞单碱基突变的B细胞。来验证该种识别单碱基突变的靶向策略的有效性。最后我们构建出不同的同源重组模板。通过不同形式的同源重组模板,对筛选出的K562(髓性淋巴母细胞瘤细胞系)以电转的方式共转pX458编辑质粒和模板。考察能否向靶位点靶向插入并表达HBVs1的抗原肽序列。结果:在第一部分中,通过与参考序列的对比确认本实验室中的HEK-293、Hela、SW480为TP53基因野生型细胞,但在HEK-293T、Jurkat、K562这3种细胞系中基因的CDS区各种存在不同的突变。在293T细胞中CDS区第840位点存在等位基因突变(“A→T”碱基替换),使得第280位氨基酸发生改变(S→R)。在Jurkat细胞中第1083位的“G”发生了碱基缺失及177位开始的200bp缺失。在K562细胞中第406位C和407位A之间发生了单个碱基“C”的插入。分析突变情况后进行sgRNA设计,最后成功地构建了pX458-K562 sgRNA,pX458-293T 1sgRNA,pX458-293T 2sgRNA,3个编辑质粒。第二部分实验中,通过对质粒和电转条件的优化,得到了适宜本实验室K562细胞的转染pX458质粒电转条件(K562 215v 3ms)转染效率可达到:K562 48.4%。另外用磷酸钙转染法对HEK-293T进行转染,效率达到34.7%、21.3%。另外我们在这部分实验中验证了识别单碱基突变的靶向策略的有效性。第三部分实验中,我们选用乙肝病毒表面蛋白序列,利用在线分析选用了“WLSLLVPFV”肽序列,命名为HBVs1将其作为插入K562细胞TP53突变位点的表位肽序列。我们成功的验证了ssDNA模板在共转中靶向插入了K562突变靶点。测序峰图显示切割位点左臂后紧接着出现的HBVs1序列。而在带有红色荧光标记的Donor质粒共转后也观察到了带有红色荧光的表达的K562。为了后续呈递该插入的表位,我们成功构建了一双表达HLAA020101分子和B2m分子的慢病毒穿梭质粒,为后续的杀伤实验奠定了基础。结论:运用CRISPR/Cas9技术,针对癌细胞系中存在的特定基因突变进行识别,靶向编辑并特异地在突变位点插入外源抗原肽编码序列的策略是可行的。但是插入整合的效率仍需要进一步的提高。