【目的】利用已构建的真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,观察其在小鼠鼻粘膜细胞内的表达,检测其所诱发的特异性体液免疫应答(尤其是粘膜免疫应答)和细胞免疫应答水平,为研制高效的淋球菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】①真核质粒的鉴定。提取真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA行PCR及双酶切鉴定。②观察真核重组质粒在小鼠鼻粘膜细胞内的表达。真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w取小鼠鼻粘膜采用免疫组织化学法检测NspA、LTB、LTB-NspA蛋白的表达。③nspA-ltB核酸疫苗免疫活性的检测。取真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和PBS组,共免疫3次。每次免疫前一天及末次免疫后2w经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平;同时用PBS冲洗小鼠生殖道,收集其生殖道冲洗液,间接ELISA法检测冲洗液中NspA特异性SIgA抗体水平。末次免疫后2w取小鼠脾淋巴细胞于37℃5%CO2培养箱中培养后,MTT法检测淋巴细胞增殖水平,间接ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。【结果】真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,经鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w采用免疫组织化学法检测到重组蛋白在小鼠鼻粘膜细胞内表达;实验组pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA小鼠生殖道冲洗液中NspA特异性SIgA水平明显高于对照组(P<0.01),且含粘膜佐剂的pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组较单基因pcDNA3.1(-)/nspA组高(P<0.05)。实验组小鼠血清中NspA特异性IgG抗体明显高于对照组(P<0.01);但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组与单基因pcDNA3.1(-)nspA组比较,特异性IgG抗体水平差异不显著(P>0.05)。实验组小鼠脾淋巴细胞经特异性NspA抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显高于对照组(P<0.01) [pcDNA3.1(-)/nspA组达153.79±19.03pg/mL,pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组达160.56±25.67pg/mL,与pcDNA3.1(-)/ ltB组(60.56±11.45pg/mL) ,空质粒组pcDNA3.1(-) (40.34±9.89pg/mL)和PBS组(25.75±6.12pg/mL)之间有显著性差异(P<0.01),两实验组间IFN-γ含量差异不显著(P>0.05)。MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平, pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组和pcDNA3.1(-)/nspA组小鼠脾淋巴细胞经特异性NspA抗原刺激后,刺激指数分别为(1.653±0.32)和(1.598±0.25),明显高于对照组[pcDNA3.1(-)/ltB组(1.122±0.21),空质粒组pcDNA3.1(-) (1.134±0.17)和PBS组(1.014±0.10) (P<0.01)],两实验组间刺激指数差异不显著(P>0.05)。【结论】1、用构建好的pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA核酸疫苗,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答(尤其是粘膜免疫应答)和细胞免疫应答。2、真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,能在鼻粘膜细胞内获得表达。3、证实了LTB作为粘膜佐剂与NspA融合,通过鼻饲免疫后能提高NspA诱导的特异性SIgA水平。