大鼠触须毛囊上段再生的体外培养

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目的:分离生长期大鼠触须毛囊,获取毛囊上段组织,体外培养,筛选最优培养液;构建毛囊上段体外再生模型,为毛囊切割后毛乳头体外再生奠定基础。方法:(1)大鼠麻醉后,颈断处死,整个大鼠放入75%酒精中消毒,然后转移到超净工作台,剪下大鼠的触须部嘴唇,再次消毒,沿着毛囊平行走向将组织剪成细条状,用显微器械分离得到单个毛囊,仔细去除毛囊的周围组织,注意避免损伤到毛囊。(2)用镊子轻轻挤压毛囊上端,可见红色的含毛乳头的毛球部暴露于毛囊下端,紧贴毛球部上方用刀片将其横向切除,并拔除毛囊的毛发,最终得到大鼠触须毛囊上段标本。(3)将其分别培养于含5%胎牛血清(FCS)MEM、含5%FCS MEM+10ng·ml-1胰岛素生长因子1(IGF-1)+20ng·ml-1表皮生长因子(EGF)、5%FCS MEM+10-7mmol/L双氢睾酮(DHT)+10ng·ml-1IGF-1+20ng·ml-1EGF、Williams E无血清培养液、Williams E无血清培养液+10ng·ml-1IGF-1+20ng·ml-1EGF、Williams E无血清培养液+10-7mmol/LDHT+10ng·ml-1IGF-1+20ng·ml-1EGF共计6种不同培养液中,在37℃,5%CO2培养箱中培养,隔日换液,并在光学显微镜下观察其生长情况。(4)显微镜下统计毛囊再生个数,筛选培养液。(5)相关标本制备石蜡切片,HE染色,显微镜下观察。(6)标本酶标免疫组化检测,观察α-平滑肌收缩蛋白(α-SMA)在毛囊新生组织中的表达情况。结果:(1)大鼠触须毛囊较大,肉眼容易观察,大鼠触须毛囊上段获取容易,毛囊切面光滑,切除方法效果良好;拔除毛囊毛发后的毛囊上段组织,其质地较前稍微有些软化,但结构依然完好,毛囊下端的切缘平整光滑。(2)部分毛囊上段体外培养后第4天,外根鞘细胞增殖并填充拔除毛发后留下的空腔,部分外根鞘细胞突出到玻璃膜底部切缘之外。第9天,外根鞘细胞和真皮鞘细胞继续增殖,部分真皮鞘细胞移动到底部外根鞘中,毛囊断端被结缔组织包裹,结缔组织鞘基本规则,毛囊组织切缘痕迹不再明显,但没有毛乳头形成。(3)6中不同培养液相比较,5%FCS MEM+10-7mmol/LDHT+10ng·ml-1IGF-1+20ng·ml-1EGF培养液是比较适合大鼠触须毛囊上段的体外培养液。该培养液中,毛囊上段组织再生数目最多,出现组织塌陷及细胞死亡的时间最长,差异具有统计学意义。(4)α-SMA广泛地表达于整个毛囊的各个部位,主要表达在真皮鞘及毛乳头,特别是毛囊下段紧挨着玻璃膜的真皮鞘细胞和毛乳头底部的细胞群,下段外根鞘的外层细胞中也有微弱的α-SMA表达。结论:(1)5%FCS MEM+10-7mmol/LDHT+10ng·ml-1 IGF-1+20ng·ml-1EGF培养液是比较适合大鼠触须毛囊上段的体外培养液;(2)本研究建立的大鼠触须毛囊上段体外再生的模型,毛囊体外再生率较高、结果可靠,可以作为研究毛囊体外再生的良好平台,为进一步研究毛乳头体外再生奠定基础。
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