[背景和目的]肠道是对缺血-再灌注(I／R)损伤最敏感的器官。肠缺血-再灌注损伤是外科常见的危重病症，它不仅可以引起肠粘膜上皮细胞吸收功能下降、肠粘膜屏障功能受损及肠道内正常菌群失调，而且可以导致肠源性细菌和内毒素移位到体循环，激发机体免疫反应，引起网状内皮系统发生系列反应，造成大量相关炎症介质和细胞因子释放，可以导致全身性炎症反应综合征(SIRS)甚至多器官功能障碍综合征(MODS)，具有较高的发病率和死亡率。因此，研究肠缺血-再灌注损伤的发生机制和寻找防治肠缺血-再灌注损伤的措施已成为目前外科领域的研究热点。缺血预处理被众多学者公认为是一种有效的抗缺血-再灌注损伤的治疗策略。缺血预处理由Murry等在1986年首先提出，指心肌在经受多次短暂缺血和再灌注，能减轻随后长时间缺血-再灌注导致的心肌损伤。大量研究证实，这一现象存在于不同种属的不同组织器官中，包括肠组织。但由于这种预处理必需在缺血前实施，而临床患者常常由于其自身原发性疾病的存在，使得术前肠组织已经处于严重缺血状态，从而在根本上失去了缺血预处理的时机，其临床应用价值受到了很大的限制。因而针对已缺血肠组织，采取其他更合理的处理时机和措施以减轻再灌注损伤，无疑具有更直接的临床意义。新近研究发现，缺血后处理(IPOST)是一种抗缺血-再灌注损伤的新的机械性干预措施。2003年，Vinten-Johansen’s研究小组对犬的缺血-再灌注研究中发现，在心肌较长时间缺血后，再灌注一开始即对心脏进行3个循环的再灌注／停灌注处理，即30秒再灌注／30秒再阻断，结果表明这种新的机械性干预措施可以缩小心肌梗塞面积，保护内皮功能，减轻细胞水肿，减少缺血梗死区中性粒细胞的聚集，改善心功能，能够发挥心脏保护作用。这一保护作用在程度上和缺血预处理相似，他们把这种现象称为缺血后处理。随后，缺血后处理抗损伤的保护作用在一些缺血-再灌注损伤的动物实验和临床研究中也得到证实。目前，对缺血后处理的研究尚属起步阶段，大多集中在缺血-再灌注损伤的心肌和肝脏方面的研究。然而，缺血后处理对肠缺血-再灌注的抗损伤作用及其机制的研究国内外尚未见报道。因此，本研究通过与缺血预处理对比研究，从整体、细胞和分子水平上阐明缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用及其可能的作用机制，从而为抗肠缺血-再灌注损伤的基础研究奠定一定的理论和实验依据，为临床外科防治肠缺血-再灌注损伤提供新的策略。[方法]SPF级健康SD成年雄性大鼠，体重220-250g，被随机分为①假手术组(Sham组)：仅行开腹，分离肠系膜上动脉(SMA)不夹闭；②缺血-再灌注组(I／R组)：无创血管夹夹闭SMA 45 min松开血管夹；③缺血预处理组(IPC组)：夹闭SMA5 min和松夹5 min作为预处理，2个循环，余同I／R组；④缺血后处理组(IPOST组)：缺血45 min后即刻行3个循环的灌注30 s／阻断30 s，余同I／R组。本研究分四部分：1．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤作用研究方法：应用病理形态学、细菌学、动态浊度法、酶联免疫吸附法(ELISA)和生物化学等方法，观测各组大鼠肠粘膜病理形态学、肠组织湿／干比重(W／D)，肠道细菌向肠系膜淋巴结、肝、脾移位的频率及组织细菌含量，门、腔静脉血清内毒素含量，腔静脉血清TNF-α含量和肝功能变化。从不同方面评价缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用。2．缺血后处理对大鼠肠缺血-再灌注损伤的抗氧化作用机制研究方法：应用分光分析法分别检测各组大鼠肠粘膜中丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化。评价抗氧化作用在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤机制中的作用。3．缺血后处理对大鼠肠缺血-再灌注损伤的抗细胞凋亡作用机制研究方法：应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)、DNA琼脂糖凝胶电泳方法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫组织化学方法分别检测各组大鼠肠粘膜细胞凋亡发生情况以及肠粘膜细胞Bcl-2／Bax mRNA及其蛋白表达的变化。评价抗细胞凋亡作用在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤机制中的作用。4．线粒体在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤中的作用机制研究方法：应用透射电子显微镜(TEM)、MTT法、激光共聚焦扫描显微镜分别观测各组大鼠肠粘膜细胞线粒体形态结构改变，线粒体呼吸功能以及肠粘膜细胞线粒体跨膜电位的变化。评价线粒体在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤机制中的作用。[结果]1．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用研究：①肠组织病理形态学变化：假手术组大鼠肠粘膜绒毛完整，上皮下间隙无扩展。缺血-再灌注组大鼠肠粘膜部分绒毛破损，顶端与固有层分离伴固有层毛细血管暴露、出血和溃疡。缺血预处理组和缺血后处理组大鼠各时间点肠粘膜损伤程度均有减轻。缺血后处理组肠组织病理评分明显低于缺血-再灌注组(P＜0.05)，缺血后处理组与缺血预处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；②肠道细菌移位：在缺血-再灌注组、缺血预处理组和缺血后处理组大鼠共检出4种细菌，均属肠道常驻菌。缺血后处理组细菌移位频率和细菌含量均明显低于缺血-再灌注组(P＜0.05)，与缺血预处理组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；③小肠组织W／D，门、腔静脉内毒素和TNF-α含量以及肝功能变化：与缺血-再灌注组相比，缺血后处理组大鼠小肠组织W／D，门、腔静脉内毒素含量，腔静脉TNF-α含量和肝功能指标明显降低(P＜0.05)，缺血后处理组与缺血预处理组相比，各项指标差异无统计学意义(P＞0.05)。2．缺血后处理对大鼠肠缺血-再灌注损伤的抗氧化作用机制研究：与缺血-再灌注组相比，缺血后处理组大鼠肠粘膜MDA含量和MPO活性均显著降低(P＜0.05)，而SOD活性明显升高(P＜0.05)，缺血后处理组和缺血预处理组相比，各项指标无统计学意义(P＞0.05)。3．缺血后处理对大鼠肠缺血-再灌注损伤的抗细胞凋亡作用机制研究：①肠粘膜细胞凋亡的变化：琼脂糖凝胶电泳显示，缺血-再灌注组大鼠肠粘膜细胞可见到明显的DNA断裂梯状带，而缺血后处理组和缺血预处理组则有所减轻；TUNEL法结果显示，假手术组大鼠肠粘膜细胞凋亡率较低，缺血-再灌注组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)，缺血后处理组细胞凋亡率明显低于缺血-再灌注组(P＜0.05)，缺血后处理组和缺血预处理相比差异无统计学意义(P＞0.05)；②肠粘膜细胞Bcl-2和Bax mRNA、蛋白表达变化：假手术组大鼠肠粘膜细胞Bcl-2及Bax mRNA和蛋白有一定量的表达；缺血-再灌注组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降，Bax mRNA和蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)，缺血后处理组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显上升，Bax mRNA和蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)，与缺血预处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。4．线粒体在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤中的作用机制研究：①肠粘膜细胞线粒体结构变化：假手术组大鼠肠粘膜细胞线粒体基本正常，缺血-再灌注组线粒体明显肿胀，空泡变性；缺血后处理组和缺血预处理组线粒体损伤有所恢复。②肠粘膜细胞线粒体呼吸功能变化：与假手术组相比，缺血-再灌注组大鼠肠粘膜细胞线粒体呼吸功能明显下降(P＜0.05)；缺血后处理组明显高于缺血-再灌注组(P＜0.05)，与缺血预处理组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。③肠粘膜细胞线粒体跨膜电位的变化：与假手术组相比，缺血-再灌注组大鼠肠粘膜细胞线粒体跨膜电位显著下降(P＜0.05)；缺血后处理组则明显高于缺血-再灌注组(P＜0.05)，与缺血预处理组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。[结论]1．肠缺血-再灌注使大鼠肠道结构和功能受损，表现为肠粘膜和线粒体形态改变，肠组织W／D增加，肠粘膜细胞凋亡增加，肠道细菌和内毒素移位，TNF-α产生增多，肝功能受损，MDA含量增加，SOD活性下降，MPO活性升高，Bcl-2mRNA及蛋白的表达下降，Bax mRNA及蛋白的表达升高，线粒体呼吸功能和线粒体跨膜电位下降。2．缺血后处理能够减轻缺血-再灌注大鼠肠道细菌和内毒素移位，减少TNF-α生成，改善肝功能，保护肠粘膜屏障功能，具有显著的抗肠缺血-再灌注损伤作用。3．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤作用机制与抗氧化作用有关，可能是通过清除氧自由基，抑制脂质过氧化，提高肠组织的抗氧化能力，减轻中性粒细胞的聚集发挥作用。4．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤作用机制与抗细胞凋亡作用有关，可能是通过调控细胞凋亡相关基因Bcl-2／Bax mRNA和蛋白的表达。5．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用机制与改善肠粘膜细胞线粒体形态结构和呼吸功能，提高线粒体跨膜电位有关。6．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用及其机制和缺血预处理有相似之处。7．缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用及其机制的研究有助于为抗肠缺血-再灌注损伤的基础研究奠定一定的理论和实验依据，可为临床外科防治肠缺血-再灌注损伤提供新策略。