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研究背景缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是全球最常见的死亡原因之一,其目前最有效的治疗策略是迅速恢复心脏中缺血部位的血液供应（也称为再灌注治疗）。然而,再灌注本身也可引起进一步的心肌损伤,即心肌缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）。IRI的病理过程复杂,其病理机制尚未彻底阐明。研究认为氧化应激、钙离子超载、生理p H值的快速恢复、线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）的开放、代谢紊乱和炎症反应为其主要病理介导因素。其中,再灌注期产生大量的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）导致前氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱,大量的ROS引起细胞损伤,导致心肌细胞坏死和凋亡的现象称为氧化应激。氧化应激被认为是心肌缺血再灌注损伤的主要原因。抑制心肌细胞氧化应激及氧化应激导致的心肌细胞凋亡和坏死是临床干预缺血再灌注损伤的重要策略,对缺血类心脏疾病病人的预后具有重要意义。心肌缺血再灌注损伤严重降低了再灌注治疗的益处,影响患者的治疗。目前基础研究和临床研究中用于缓解心肌缺血再灌注损伤的干预措施主要包括:缺血预适应、缺血后适应、远程缺血调节和药物干预。以上措施虽然能够一定程度上缓解心肌缺血再灌注损伤,然而,大部分研究还局限在基础实验阶段,而且在临床应用过程中都存在一定的局限性,其临床效果还有待进一步验证。大量研究表明,缺血预适应和后适应等治疗手段对心肌的保护作用与激活再灌注损伤补救激酶（Reperfusion injury salvage kinase,RISK）信号通路相关。RISK信号通路主要包括ERK1/2途径和PI3K/Akt途径。PI3K/Akt和ERK1/2两条信号通路的激活可以调控其下游靶标糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的活性,同时促进己糖激酶-II（Hexokinase-II,HK-II）与线粒体的结合,并调控Bcl-2家族等线粒体相关的蛋白,最终抑制线粒体的结构和功能的损坏,对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用。RISK信号通路是抑制缺血再灌注损伤最重要的靶标之一。异甜菊醇是甜菊醇的对映体,是由贝壳杉烷类化合物甜菊醇苷中化学提取的一种单体。异甜菊醇钠（Isosteviol sodium,STVNa or KP-4）是异甜菊醇的钠盐形式。研究表明,异甜菊醇具有抑制豚鼠和大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。然而,KP-4在缺血再灌注中的心肌保护作用及其潜在作用机制尚不完全清楚,需要进一步研究。目的探究KP-4抑制心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制。本课题组前期研究表明,KP-4能够抑制心肌细胞的线粒体损伤。因此,本研究试图探索其是否通过Akt/GSK-3β信号通路和HK-II途径来抑制线粒体损伤,从而缓解心肌细胞氧化应激损伤,起到对心肌的保护作用的。方法（1）采用Langendorff离体心脏灌流系统,通过结扎左前降支冠状动脉的方法构建大鼠急性心肌缺血再灌注模型,停灌-复灌的方法构建大鼠离体心脏停跳-再灌注模型。（2）以Powerlab系统连续记录不同时间点的血流动力学指标,对结果分析后用心率（Heart rate,HR）、左室内压最大上升速率(Maximal rise rate of left ventricularpressure,+dp/dtmax)、左心室发展压（Left ventricular development pressure,LVDP）等指标来评价离体心脏的心功能。采用称重法收集并记录不同时间点的冠脉流量（Coronary flow,CF）。采用生化分析仪测定停跳-再灌注灌流液中的肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme,CK-MB）、心肌肌钙蛋白T（Cardiac troponin T,c Tn T）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）浓度。（3）采用过氧化氢（H2O2）构建H9c2心肌细胞氧化应激模型。通过对细胞活力、LDH释放、细胞的凋亡和坏死水平以及细胞核形态的检测,评价KP-4抗氧化应激损伤的作用。通过检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量来评价KP-4的抗氧化能力。（4）采用Western Blot检测Bcl-2/Bax,p-S473 Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β和HK-II的变化情况,探究KP-4预处理抑制H9c2氧化应激损伤的可能机制。通过JC-1染色和激光共聚焦显微镜,检测线粒体膜电位水平。结果（1）KP-4能够改善缺血再灌注后心脏的血流动力学参数(CF,+dp/dtmax和LVDP),并且能够降低停跳-再灌注后灌注液中的心肌酶（CK-MB、c Tn T和LDH）浓度。（2）KP-4预处理能够抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力的降低和LDH的释放,维持细胞和细胞核正常的形态,同时使细胞的凋亡和坏死水平降低。此外,KP-4能够降低氧化应激时H9c2细胞内的ROS水平和MDA浓度,同时提高SOD活性。（3）KP-4预处理上调了H9c2心肌细胞Akt和GSK-3β的磷酸化水平,并促进了HK-II与线粒体的结合,同时提高线粒体膜电位和Bcl-2/Bax的水平。（4）LY290004（PI3K抑制剂,特异性的抑制Akt信号通路的信号传导）抑制Akt的磷酸化则消除了KP-4的这种作用,使细胞活力和GSK-3β磷酸化水平降低。结论:（1）KP-4能够改善离体大鼠心肌缺血再灌注的心功能。（2）KP-4抑制心肌缺血再灌注损伤的作用可能与其抑制心肌细胞氧化应激损伤有关。KP-4可以有效抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤,而Akt/GSK-3β信号通路和HK-II途径参与了KP-4对心肌细胞的保护作用。