与节律蛋白PER1相互作用的新蛋白的寻找及功能研究

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近日节律(circadian rhythms)由生物钟(近日节律钟)系统产生和调控。该系统在调节生物的生理功能,并使之与外界环境相适应方面起着重要的作用。目前研究证明PER1是近日节律分子振荡中的关键性蛋白,主要通过蛋白与蛋白作用的方式发挥功能。但PER1通过何种途径发挥作用目前还不十分清楚。通过对与PER1相互作用的蛋白研究不仅可以进一步阐明近同节律钟系统的分子振荡机制,还有可能揭示与生物节律相关疾病的发病机制,进而寻找治疗这些疾病的有效方法。 PAS结构域是PER1蛋白与其它蛋白发生相互作用的关键结构。因此我们以hPER1的PAS结构域为诱饵蛋白构建酵母双杂交系统。通过酵母双杂交在人脑组织筛选能与之相互作用的的新蛋白。筛选得到28个阳性克隆,进一步测序和比对发现层粘连蛋白受体1(LAMR1)能与PER1发生相互作用。体外免疫共沉淀亦进一步证实二者的相互作用。利用RT-PCR技术检测LAMR1在脑、肺、心、肝、肾组织,以及在SH-SY5Y细胞中表达的节律性质。另外,通过RNA干扰技术研究LAMR1与PER1的关系,并对PER1在细胞增殖和迁移方面的作用进行初步探讨。 结果发现Lamrl在人的脑、心脏、肝脏、肺以及肾脏组织广泛表达。在体外培养的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y中,hPerl在mRNA水平的表达呈现近日节律,而Lamrl的表达无明显的节律变化。hPerl的RNA干扰实验显示当hPerl表达下调对Lamrl的表达无明显影响。进一步的免疫细胞化学实验提示mPERl能影响LAMRl在小鼠NIH3T3细胞内的分布,当mPERl表达升高时会减少LAMR1在NIH3T3细胞膜上的分布,而上调NIH3T3细胞内的PER1蛋白表达,提示PER1蛋白具有抑制细胞增殖的作用。同样在上调PER1蛋白表达时,发现细胞迁移的关键性蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)在RNA和蛋白水平的表达受到抑制。 结合前期研究发现的PER1在肿瘤组织的表达较正常组织显著降低以及LAMR1在肿瘤的增殖和迁移中发挥着重要作用,而且LAMR1对肿瘤的迁移和侵袭正是通过对MMP-2的调控发挥作用的。由此推测PER1很可能是通过LAMR1发挥对细胞增殖和迁移的调控作用。
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