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背景近年来,糖尿病（DM）的发病率逐渐升高,糖尿病的并发症日益受到广泛关注。糖尿病病人常伴随着脑部疾病（糖尿病脑病,DE）的产生,其临床表现为:轻、中度认知功能障碍,学习和记忆能力下降,判断能力、理解能力等下降并伴有神情淡漠,目光呆滞,反应迟钝等。其中,学习、记忆障碍是DE的主要临床表现。其发病机制涉及多种因素,其中神经递质在并发症中的作用正在研究中。动物体内的神经递质及其相关物质在神经通路传递过程中具有重要作用,即可调节对信息的获取、储存等学习记忆生理活动。有研究表明,大脑不同部位对学习和记忆的影响不同,但尤以大脑皮层、海马为主。脑内神经递质可分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质。兴奋性神经递质作用于受体后,可促进学习和记忆等生理过程;若过度增加,使得神经元持续性去极化,造成神经毒性,最终导致细胞死亡。抑制性神经递质可作用于突触前减少Glu的释放,同时使得突触后神经元处于保护状态;当抑制性神经递质浓度升高时,使神经元处于超抑制状态,从而影响神经递质传递过程,学习和记忆能力下降。脑内神经递质对大脑维持正常的生理活动有关键作用,其浓度的变化可诱发认知缺陷、学习障碍、帕金森等多种神经疾病。定量测定大脑内各物质的浓度对临床疾病的控制有重要作用。目前,较少使用HPLC-FLD法同时测定氨基酸类和单胺类物质的含量,因此,本文分为三个部分分别探讨同时测定9种物质含量的HPLC-FLD方法,同时测定高半胱氨酸及半胱氨酸的HPLC-ECD方法以及11种物质在糖尿病病程中的含量变化。第一部分大鼠脑组织和血浆中9种物质测定方法的建立目的:建立同时测定大鼠脑组织和血浆中9种物质的HPLC-FLD方法。方法:采用Agilent 1260 HPLC仪,配有荧光和紫外检测器。色谱条件如下:色谱柱为Hypersil BDS（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相A为pH=6.0的缓冲液(含35 mmol·L-1醋酸钠,5 mmol·L-1柠檬酸),流动相B为甲醇;梯度洗脱程序为:0-23 min:28%B,23.01min:60%B,分析时间为35 min;荧光检测:激发波长为335 nm,发射波长为460 nm;柱温为30℃;流速为1.0 mL·min-1;进样体积为20μL。海马、皮层和血浆样品经预处理后进样测定。结果:天冬氨酸（Asp）,谷氨酸（Glu）,甘氨酸（Gly）,牛磺酸（Tau）,γ-氨基丁酸（GABA）,色氨酸（Trp）,蛋氨酸（Met）,5-羟色胺（5-HT）,多巴胺（DA）分离较好。9种待分析物的标准曲线的r2≥0.9991。最低检测限为0.8-9.2 ng·mL-1,定量限为:2.6-30.5 ng·mL-1。相对回收率为79.82%-111.11%,绝对回收率为77.79%-100.25%,日内和日间精密度的RSD分别小于10.01%和12.80%。结论:本文建立的检测方法简便、快速,分离度好,灵敏度高,适用于与糖尿病并发症相关的物质的分离测定。第二部分大鼠脑组织和血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的HPLC-ECD测定方法研究目的:建立同时测定大鼠脑组织和血浆中2种物质的HPLC-ECD方法。方法:日本岛津HPLC（LC-20AD）仪,配有电化学检测器（ED723）和DAD检测器。色谱条件为:色谱柱为C18（4.6 mm×250mm,5μm）分析柱;流动相为甲醇:醋酸盐缓冲液(30 mmol·L-1醋酸钠,100μmol·L-1辛烷磺酸钠,pH=5.0)=0.1:99.9,v/v;分析时间为30 min;检测电压为900 mv。柱温为30℃。流速为0.7 mL·min-1。进样体积为20μL。样品预处理方法如下:海马和皮层称重,按1:3（m:v）的比例加入超纯水,用玻璃匀浆器手动匀浆。取匀浆液或血浆100μL,加入10μL 2 mol·L-1的四氢硼酸钠溶液,涡旋1 min,静置5 min后,加入200μL 0.4 mol·L-1高氯酸,涡旋30 s,于15000×g,4℃,离心15 min,取上清液直接进样测定。结果:高半胱氨酸和半胱氨酸得到良好分离,其分离度大于2。在浓度0.02-4μg·mL-1范围内,线性关系良好,标准曲线的r2≥0.9991。最低检测限为5-10ng·mL-1,定量限为10-20 ng·mL-1。相对回收率79.82%-110.18%,绝对回收率84.26%-100.25%,日内和日间精密度的RSD分别小于6.71%和9.96%。结论:所建立的检测方法操作简便,灵敏度高,适用于生物样品中高半胱氨酸和半胱氨酸的分离测定。第三部分糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层和血浆中11种神经递质的含量测定目的:测定正常组、糖尿病模型及给药组大鼠海马、皮层、血浆中11种物质的含量,探讨11种物质的含量变化与糖尿病并发症之间的关系。方法:雄性SD大鼠50只,用SPF级基础饲料适应性喂养一周后分组进行实验,包括对照组、糖尿病组、胰岛素组、维格列汀组和二甲双胍组。收集各组大鼠的脑组织和血浆样品,样品经预处理后进样测定。结果:与对照组比较,糖尿病组大鼠皮层中Gly、GABA、Trp、Met、5-HT和Cys的浓度有显著性差异（p<0.05）。糖尿病组大鼠海马中Glu、Trp和Met的浓度有显著性差异（p<0.05）。糖尿病组血浆中Asp、Glu、Trp和DA的浓度有显著性差异（p<0.05）。三种药物均可不同程度的改善由糖尿病所引起的几种物质含量的变化。结论:与正常组比较,糖尿病组中这几种物质浓度在中枢和外周均有不同程度的差异,提示11种物质的含量变化与糖尿病的并发症有关。