凡纳滨对虾组织蛋白酶C基因的克隆、表达与定量分析

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组织蛋白酶C(cathepsin C)是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族,广泛存在于无脊椎动物及脊椎动物当中,其具有非常重要的生理功能。组织蛋白酶C除了能在溶酶体内从蛋白质底物的氨基酸末端除去二肽,还可作为体内多种功能性蛋白酶(如:粒酶A和B,中性白细胞弹性蛋白酶、cathepsin G、胰凝乳蛋白酶等)的激活酶,并能影响细胞增殖生长。一些人类重大疾病就是由于组织蛋白酶C的突变失活而引起的。因此,研究组织蛋白酶C与对虾免疫性的相互关系对于提高对虾抗病能力有着极大意义,并为对虾免疫机理提供重要的理论依据。 本研究通过RACE(rapid amplication of cDNA ends)方法,利用已获得的组织蛋白酶C的EST序列设计特异性引物,从凡纳滨对虾的血淋巴组织中克隆了组织蛋白酶C基因,其全长为2026bp,3端具有poly(A)结构,该基因含有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),共编码451个氨基酸,推导其编码蛋白的分子量为50.76 kDa,理论等电点约为6.01。通过Blast同源性比对组织蛋白酶C的氨基酸序列,凡纳滨对虾与日本囊对虾和斑节对虾的组织蛋白酶C的氨基酸序列具有高度的相似性(分别为84.45%和86.13%)。 根据获得的组织蛋白酶C基因全长序列设计上下游引物,扩增出完整编码区片段,通过双酶切连接反应构建pET32-CatC表达载体,并进行IPTG(1 mmol/L)诱导5小时,表达产物经SDS-PAGE检验,证明是凡纳滨对虾的组织蛋白酶C的重组蛋白。 通过荧光定量PCR技术(Fluorescent quantitative real-time PCR)对攻毒溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后凡纳滨对虾组织蛋白酶C基因在虾体内表达情况进行检测,发现组织蛋白酶C基因在凡纳滨对虾血淋巴、肌肉及肝胰腺组织中都有表达,相对来说在血淋巴及肌肉组织的表达量非常丰富;另外组织蛋白酶C基因在凡纳滨对虾血淋巴组织里随着时间变化具有以下规律:组织蛋白酶C基因表达量在最初几个小时随时间变化递增,并在第4小时其表达量达到最大,随后在第8小时后慢慢的恢复到control水平。
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