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目的探讨柚皮素抗乳腺癌的作用及其分子机制,构建乳腺癌耐吉西他滨耐药细胞株及肝转移模型以及探讨柚皮素与吉西他滨协同杀伤乳腺癌细胞作用。内容和方法1.柚皮素对乳腺癌细胞的杀伤作用(1)通过CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术检测了柚皮素对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞细胞株的杀伤作用;(2)通过对小鼠皮下接种肿瘤细胞建立乳腺癌小鼠移植瘤模型,并以腹腔注射方式用柚皮素干预模型小鼠,探讨柚皮素的体内抗肿瘤作用。(3)通过荧光定量PCR和免疫印迹实验检测自噬相关基因,探讨柚皮素对乳腺癌细胞自噬的影响。2.B超弹性成像监测下应用吉西他滨耐药乳腺癌细胞4T1构建裸鼠乳腺癌肝转移模型(1)连续低剂量药物处理构建吉西他滨耐药乳腺癌细胞株4T1。(2)B超监测下应用吉西他滨耐药乳腺癌细胞4T1构建裸鼠乳腺癌肝转移模型。3.柚皮素可延缓吉西他滨耐药性(1)通过qPCR和cck-8检测柚皮素和吉西他滨对乳腺癌细胞杀伤作用的协同作用。(2)通过qPCR和cck-8检测柚皮素和吉西他滨对吉西他滨耐药乳腺癌细胞株的杀伤作用,探讨柚皮素对吉西他滨耐药的作用。结果1、经柚皮素处理后,人乳腺癌细胞株MCF-7细胞和小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞平板克隆能力下降(p<0.001)。2、经柚皮素处理后,人乳腺癌细胞株MCF-7细胞和小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞出现明显的凋亡(p<0.001)。3、经柚皮素处理后,乳腺癌细胞自噬相关基因Beclin1、BAX出现明显增加(p<0.001),乳腺癌细胞自噬相关基因ATG5、HIF-1α和Bcl-2出现明显增加(p<0.01),证明发生了明显的自噬。4、柚皮素可明显抑制4T1细胞小鼠移植瘤体积增加(p<0.001)和体重增加(p<0.01)。5、成功诱导吉西他滨耐药的4T1细胞(4T1/Gem)。亲代细胞和耐药细胞增值抑制率,IC50(4T1)=0.0126mg/ml、IC50(4T1/Gem)=9.9357mg/ml,RI=788.547。6、建立稳定的吉西他滨耐药的4T1细胞(4T1/Gem)并建立裸鼠肝转移模型。7、小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞增殖实验中柚皮素(Nar)+吉西他滨(Gem)抑制4T1细胞优于Nar(p<0.05),Nar+Gem抑制4T1细胞优于CTL(p<0.001)。8、小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞与小鼠乳腺癌细胞系4T1/Gem细胞增殖实验检测Nar+Gem抑制4T1/Gem细胞优于4T1细胞(p<0.05)。结论1.柚皮素可以抑制乳腺癌细胞的增殖,而且对正常乳腺细胞无明显或只有较小的毒副作用。柚皮素通过凋亡和自噬方式促进乳腺癌细胞的死亡。2.柚皮素对小鼠移植瘤具有明显的抑制作用,并可促进其坏死;3.成功构建吉西他滨耐药的4T1细胞,并成功构建其肝转移模型;4.柚皮素可以与吉西他滨协同杀伤乳腺癌细胞,并可延缓乳腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。