吸烟是导致我国慢性阻塞性肺疾病的主要因素之一,并可能进而引起继发性肺动脉高压及慢性肺源性心脏病。肺血管重构是引起继发性肺动脉高压并进一步导致慢性肺源性心脏病的最重要的机制之一。最近几年的多项研究资料表明,吸烟可以不依赖于缺氧、肺功能改变以及血管床的损毁等过程而直接作用于肺血管,引起肺血管重构并参与肺动脉高压的形成。但是,其具体的分子机制目前并未完全清楚。蛋白激酶C(PKC)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族,它参与调控了体内的多种细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和粘附等各种生物学的过程。我们实验室通过最近几年的研究后发现,香烟烟雾可以引起蛋白激酶Cα(PKCα)的表达上调和功能活化,而活化的PKCα再通过其下游的一系列信号传导途径促使肺动脉平滑肌细胞的异常增殖,这可能是吸烟直接参与肺血管重构形成的重要机制之一。但是,关于PKCα下游尤其是细胞核内的具体分子机制,目前知之甚少。以往的许多研究资料表明,PKC可以通过影响细胞周期蛋白来参与调控细胞的增殖或凋亡过程。在细胞周期过程中,cyclinD1是调控细胞周期中G1／S期转换的最重要的周期蛋白之一,其与多种肿瘤的发生发展关系密切。而最近几年的研究却发现,cyclinD1参与了体内的多种其他生理或病理过程,如妊娠晚期胎盘的血管生成、肝脏的再生以及心室的重构等。但是,由于细胞和组织类型的不同,以及各种刺激因素的不同,有可能导致cyclinD1对各种细胞增殖或凋亡的调控作用有所不同,甚至有可能是相反。目前,关于cyclinD1是否参与了吸烟导致的肺血管重构过程以及在此过程中的具体作用,仍不十分清楚。虽然PKC可以通过对cyclinD1表达的调控来参与细胞的增殖或凋亡过程,但是在不同的细胞和组织中,PKC有可能对cyclinD1的表达有着完全不同的调控作用。比如,在各种上皮细胞和平滑肌细胞中,PKC对cyclinD1的影响可以是促进其转录和表达,也可以是抑制其转录和表达,这也决定了PKC在各种细胞的增殖或凋亡过程的作用不尽相同。目前,在肺血管中PKC对cyclinD1的表达是否具有调控作用以及具有何种调控作用,也未见国内外相关研究。基于以上的研究现状,本课题主要通过对香烟烟雾暴露大鼠的观察和干预,以及对大鼠肺动脉平滑肌细胞的体外培养和干预,以期探讨cyclinD1在吸烟导致肺血管重构过程中的具体作用及其与PKCα信号通路的关系。研究内容1.将清洁级的健康Wistar大鼠暴露于空气或香烟烟雾中各3个月。通过外周肺组织的HE染色和α-actin染色切片观察肺血管重构的程度,通过RT-PCR的方法以及WesternBlot的方法检测cyclinD1和PKCα的nRNA及蛋白表达水平。此部分试验可以明确香烟烟雾暴露对cyclinD1表达的影响,以及cyclinD1与PKCα的相关关系。2.体外培养Wistar大鼠的肺动脉平滑肌细胞(大鼠PASMCs)。同时设计并合成针对大鼠cyclinD1基因的小干扰RNA(siRNA)。将大鼠PASMCs分为四组：对照组(control),香烟烟雾提取物组(CSE), CSE+cyclinDl siRNA组(CD1-siRNA),CSE+阴性对照siRNA组(NC-siRNA)。干预24小时后,用细胞计数法和BrdU掺入率检测细胞增殖,用流式细胞术分析细胞周期,用RT-PCR的方法和Western Blot的方法检测cyclinD1的mRNA和蛋白的表达。此部分试验可以明确cyclinD1在CSE刺激的大鼠PASMCs体外异常增殖过程中的具体调控作用。3.体外培养Wistar大鼠的肺动脉平滑肌细胞(大鼠PASMCs)。设计并合成针对大鼠PKCα基因的小干扰RNA (siRNA)。将大鼠PASMCs分为四组：对照组(control),香烟烟雾提取物组(CSE), CSE+PKCa-siRNA组(PKCa-siRNA),CSE+阴性对照siRNA组(NC-siRNA)。干预24小时后,用细胞计数法和BrdU掺入率检测细胞增殖,用流式细胞术分析细胞周期,用RT-PCR的方法和Western Blot的方法检测PKCα和cyclinD1的mRNA和蛋白的表达。此部分试验可以明确PKCα是否调控了cyclinD1的表达,并进而参与CSE刺激大鼠PASMCs体外异常增殖的过程。4.将清洁级的健康Wistar大鼠暴露于空气或香烟烟雾中,制作香烟烟雾暴露模型。构建针对大鼠cyclinD1基因的shRNA质粒和阴性对照质粒,并分别在每周香烟烟雾暴露之前通过尾静脉注射到大鼠体内。三个月后处死大鼠,通过外周肺组织的HE染色和a-actin染色切片观察肺血管重构,通过RT-PCR的方法以及Western Blot的方法检测cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平。此部分试验可以明确在动物体内cyclinD1是否参与了香烟烟雾暴露大鼠的肺血管重构。研究结果1.长期的香烟烟雾暴露可以引起大鼠的肺小血管重构,同时伴随有肺小血管中cyclinD1的mRNA和蛋白水平的显著升高。CyclinD1的蛋白水平与肺小血管的管壁厚度和PKCa蛋白水平呈明显的正相关。2.香烟烟雾提取物(CSE)对大鼠PASMCs的体外增殖呈现双向作用,即低浓度(1%,2%,5%)的CSE可以促进大鼠PASMCs的体外异常增殖,而高浓度(20%)的CSE则明显抑制了大鼠PASMCs的体外异常增殖。采用针对大鼠cyclinD1基因的特异性siRNA可以显著抑制大鼠PASMCs中cyclinD1的mRNA和蛋白质水平。同时,该siRNA还可以引起细胞的G1期阻滞,明显抑制CSE所引起的细胞增殖。3.CSE可以引起大鼠PASMCs中PKCα和cyclinD1的mRNA和蛋白水平显著升高,同时导致细胞的异常增殖。而PKCα的特异性siRNA不仅可以明显抑制大鼠PASMCs中PKCα的mRNA和蛋白水平,而且可以显著下调cyclinD1的mRNA和蛋白水平。另外,该siRNA还可以引起大鼠PASMCs的G1期阻滞,明显抑制CSE所引起的细胞增殖。4.针对大鼠cyclinD1基因的shRNA表达质粒可以通过尾静脉注射的方法成功的转染到大鼠的肺血管中。该shRNA可以在体内下调肺血管中的cyclinD1的mRNA和蛋白水平,同时还可以减轻香烟烟雾暴露所引起的肺小血管肌化程度和小血管壁的厚度。结论1.香烟烟雾暴露后大鼠肺小血管中cyclinD1明显升高,并与肺小血管的重构程度和PKCα蛋白水平呈正相关。CyclinD1有可能参与了香烟烟雾暴露大鼠的肺血管重构过程。2. CyclinD1的特异性siRNA可以成功地抑制大鼠PASMCs的体外异常增殖,cyclinD1在CSE致大鼠PASMCs体外异常增殖过程中发挥了正向调控作用。3.PKCα可以上调大鼠PASMCs中的cyclinD1表达,并通过此途径来参与调控CSE刺激下的大鼠PASMCs体外异常增殖过程。4. CyclinD1的shRNA质粒可有效地减轻香烟烟雾暴露后大鼠的肺血管重构程度。CyclinD1参与了吸烟直接导致大鼠肺血管重构的发病过程。综上所述,我们认为cyclinD1在吸烟致肺血管重构的过程中发挥了重要的正向调节作用,而PKCα可以通过调控cyclinD1的表达来参与此过程。本课题从细胞周期调控和细胞信号转导通路的角度补充了吸烟导致肺血管重构的具体分子机制,有可能为将来肺动脉高压的治疗提供一点新的思路。当然,有关cyclinD1和PKCα的具体分子调控机制,还需要进一步的深入研究。