一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒是日常生活中常见的中毒之一,可造成脑、心、肺等各脏器损伤,以脑损伤发病率高且危害大。CO中毒脑损伤,临床上也称之为CO中毒神经和精神后遗症,又分为CO中毒性脑病和迟发性脑病。众多研究表明,脑白质脱髓鞘是CO中毒脑损伤最主要的病理变化。经典机制认为,CO与血红蛋白结合后,降低了氧气与血红蛋白的结合和运输,导致的细胞缺氧是中毒的核心问题。影响CO中毒脑损伤预后的可能因素包括:CO的暴露时间、年龄、高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)治疗和遗传因素等。既往研究存在病例数少、自杀患者比例不详、未进行严重程度分层以及排除意识障碍患者等局限,因而结论也不尽相同。HBO等氧疗是CO中毒治疗的主要手段,其机理主要是加快碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin,COHb)解离,恢复血液携氧能力,改善细胞缺氧。但国际上对HBO的应用指征、治疗方案、终止标准等仍然存在争议。有观点认为当体内COHb浓度小于3%时可停止氧疗。而中国《CO中毒临床治疗指南》则推荐中毒后一月内,继续给予一定次数的HBO治疗。我们既往研究发现,HBO可改善CO中毒后患者的脑白质脱髓鞘和日常生活能力。脑损伤的动物模型研究也发现,在损伤后的一段时间内重复多次给予HBO可促进髓鞘再生并改善神经功能。Notch信号通路不仅参与成年哺乳动物神经干细胞增殖的调控,还参与胶质细胞的分化。研究显示,Notch信号通路的激活与脑再灌注损伤的病理过程密切相关。CO中毒脑损伤后Notch信号通路是否会发生变化,HBO能否通过Notch信号通路来促进CO中毒脑损伤后髓鞘的修复,目前尚无定论。本课题将从临床病例、动物实验、体外细胞培养等方面展开研究:1、临床部分:以同时发生CO中毒的夫妻为研究对象,探讨CO中毒脑损伤的流行病学特点、影像学特征及预后影响因素,进一步证明脑白质脱髓鞘在CO中毒脑损伤中的重要地位。2、基础部分:建立小鼠CO中毒脑损伤模型,探索CO中毒脑白质脱髓鞘的特点及HBO的保护效应,通过检测Notch信号通路的变化,初步揭示HBO改善白质脱髓鞘的分子机制;建立离体少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)CO中毒模型,观察CO对OPCs数量、活力、迁移能力的影响,初步揭示CO中毒脑白质脱髓鞘的细胞学机制。第一部分CO中毒患者预后影响因素的分析目的探讨CO中毒患者预后的影响因素。方法1、研究对象:收集住院治疗的CO中毒夫妻资料,夫妻至少一方达到重度中毒程度。2、研究方法:比较夫妻间CO中毒1月后的格拉斯哥预后评分(glasgowoutCOmescale,gos)、好转率、死亡率;以女性是否闭经为分组因素,仍然比较夫妻间上述指标;通过logistic回归,分析性别和年龄对中毒后24小时的损伤程度及1月后预后评分的影响。结果1、入选66对夫妻,其中青壮年组36对,中老年组30对。中毒1月后,66对夫妻中女性gos评分(p=0.012)和好转率(p=0.013)好于其配偶;青壮年组女性gos评分(p=0.023)和好转率(p=0.035)好于其配偶。而中老年组gos评分和好转率,各组夫妻死亡率均无统计学差异。2、年龄对急性期严重程度无影响,性别对急性期严重程度有影响(p=0.010),女性病情轻于男性(oddsratio[or]=2.968)。3、年龄和性别对中毒1月后的gos评分均有影响,低年龄组(or=5.760)和女性(or=0.485)中毒1月后的gos评分高,预后好。4、在重度中毒患者中,性别对1月后的gos评分无影响,年龄对1月后的gos评分有影响,低年龄组gos评分高,预后好(or=5.714)。结论年龄和性别是CO中毒预后的重要影响因素。在相同中毒环境下,与其配偶相比,女性,尤其是绝经前女性,中毒程度更轻,预后更好。此外,重度中毒时女性未显示更好的预后。第二部分 CO中毒脑损伤的流行病学特点及影像学特征目的分析CO中毒脑损伤的发病率、性别差异、影像学特征以及与预后的关系。方法1、研究对象:收集住院治疗的CO中毒夫妻资料,入选夫妻与急性期中毒程度分级无关,即夫妻双方均为轻、中度中毒的也纳入研究(本研究第一部分这些患者未入选)。2、研究方法:分析CO中毒迟发性脑病、中毒脑病及二者总发病率,比较这些发病率是否存在性别差异;分析性别对神经精神后遗症患者1月后gos评分的影响;分析影像学特征,以及受损部位与预后之间的关系。结果1、根据入选患者急性期严重程度的不同,神经精神后遗症的总发病率在39.88%~64.95%之间,各组病例不同性别间的发病率均无统计学意义。2、性别对神经精神后遗症患者gos评分无影响。3、神经精神后遗症患者的影像学有三种表现:单纯白质损害、单纯基底节损害和基底节合并白质损害。基底节损害在中毒性脑病组的发生率远高于迟发性脑病组(p<0.01),脑白质损害在全部患者中的发生率为86.44%,是基底节损害发生率的两倍以上。受损部位与中毒1月后的gos评分无关。结论CO中毒脑损伤的发病率较高,根据入选患者急性期严重程度的不同,存在较大的差异。脑白质脱髓鞘改变是CO中毒脑损伤的最主要影像学特征。第三部分CO中毒小鼠脑白质脱髓鞘的特点及高压氧的脑保护效应目的观察CO中毒小鼠脑白质脱髓鞘的特点及hbo的保护效应。方法1、实验动物及分组:选取8周龄雄性c57bl/6小鼠,随机分为三组(n=6)。正常对照组(假染毒组):将小鼠置入密闭染毒箱内,持续通入空气,时间与染毒时间相等;CO中毒组:将小鼠置入密闭染毒箱内,吸入CO造模后呼吸空气;hbo组:造模后给予hbo治疗,1/日,总计3次。2、研究方法:通过检测COhb水平,判断中毒程度;每日称量体质量,监测小鼠整体状态。各组小鼠在染毒后第3~5天进行morris水迷宫训练,第6天进行定向巡航实验,第7天进行空间探索实验,第9天麻醉处死取脑组织进行fluoromyelintmgreen荧光染色、髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein,mbp)和neurofilament免疫荧光双重标记,观察胼胝体、海马区、侧脑室旁等部位脱髓鞘情况;对胼胝体组织用透射电镜观察神经纤维的超微结构变化。结果1、体质量监测显示:染毒后第7天,CO中毒组体质量增加幅度较对照组小(p<0.05);hbo组较CO中毒组增加(p<0.05)。2、morris水迷宫实验显示:CO中毒组与对照组比较潜伏期延长、穿越平台次数减少(p<0.05),hbo组较CO中毒组改善(p<0.05)。3、fluoromyelintmgreen染色结果显示:CO中毒导致胼胝体免疫荧光强度下降,髓鞘致密程度下降,与对照组比较髓鞘破坏明显(p<0.05);hbo组较CO中毒组改善(p<0.05)。4、mbp和neurofilament免疫荧光双重标记显示:CO中毒导致胼胝体和侧脑室旁髓鞘破坏明显,免疫荧光强度下降,髓鞘结构松散,稀疏不均匀;hbo可以改善上述部位的脱髓鞘;而海马区白质和各脑区轴突受损并不明显。5、电镜检查结果显示:CO中毒导致有髓神经纤维数量明显较少,髓鞘结构破坏,而hbo治疗后可使上述情况显著改善。结论CO中毒导致小鼠体质量增加幅度减小,整体状态变差,空间学习与记忆能力下降;脑白质受损主要集中于胼胝体和侧脑室旁,且以髓鞘脱失为主,轴突相对完整;海马区白质受损并不明显;胼胝体有髓神经纤维数量明显较少,髓鞘结构破坏。hbo可改善上述异常,产生保护效应。第四部分高压氧改善CO中毒小鼠脑白质脱髓鞘的机制研究目的1、探讨CO中毒对notch信号通路的影响,以及hbo的保护机制。2、探讨CO中毒对opcs数量、活力、迁移能力的影响。方法1、在体实验:(1)实验动物及分组:同第三部分。(2)研究方法:通过westernblotting检测notch1、hes5蛋白;rt-pcr检测notch1、hes5mrna水平。2、体外细胞实验:(1)opcs的体外培养及分组:将纯化的opcs分为两组。正常对照组:细胞培养箱中通入5%CO2+95%空气;CO中毒组:细胞培养箱中通入5%CO2+1%CO+94%空气。(2)研究方法:通过MTT还原实验检测OPCs存活和生长情况。利用Transwell法检测OPCs迁移能力。结果1、在CO中毒后第9天,小鼠脑组织Notch1受体及其下游靶基因Hes5无论是在蛋白水平,还是基因表达水平,都较对照组显著升高(P<0.05),而HBO治疗后可使其下降(P<0.05)。2、CO中毒后存活的OPCs数量减少,活力下降,且迁移能力也明显下降(P<0.05)。结论CO中毒激活了Notch信号通路,而HBO可抑制该通路,这可能是HBO改善脱髓鞘的机制。CO中毒抑制了OPCs的活性及迁移能力,这可能是CO中毒髓鞘受损后再生障碍的细胞学机制。