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试验研究背景与试验研究目的：
肿瘤的发生是由多基因控制，受多因素影响，多阶段多步骤发展的复杂过程。寻找肿瘤恶变过程中异常改变的基因，研究其表达调控机制，阐明其在肿瘤发生发展中的作用，将有利于我们认识肿瘤发生发展的分子机制，提高肿瘤的临床诊断和治疗率。
肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylargininedeiminase4，PADI4)编码的酶是一种翻译后修饰酶，可以在钙离子存在的情况下把精氨酸残基转化成瓜氨酸残基，此过程称做瓜氨酸化。瓜氨酸化后的蛋白往往改变其大分子构象，从而导致其生化活性发生改变。目前，在人体组织中共发现5种PADI酶，(即PADI1、2、3、4和6)，它们都簇集在染色体1P36.13上。PADI4最先从人白血病细胞系HL-60细胞克隆而来。PADI4的cDNA编码663个氨基酸，与其他三种PADI有50-55％同源性，免疫组化证实PADI4存在于人体外周血的中性粒细胞和嗜酸性细胞。
许多研究已证实PADI4是类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)的关联基因，在该病自我免疫和组织损伤过程中起着重要作用。抗凝血酶(antithrombin，AT)是分子量为52kDa的糖蛋白，对维持体内凝血与抗凝血的动态平衡有着重要的作用。我们利用体外活性分析方法发现重组的PADI4能对AT进行瓜氨酸化修饰，致使AT失去抗凝血酶活性。我们的SandwichELISA也在RA患者血液中检测出瓜氨酸化AT(citrullinatedAT，cAT)。因此，我们建议RA滑膜组织内大量表达的PADI4能将AT瓜氨酸化，瓜氨酸化后的AT失去了对凝血酶的抑制，结果凝血酶活性增高，加速催化纤维蛋白原成为不溶性纤维蛋白，并刺激血管内皮生长因子受体表达和血管内皮细胞增生，最终导致类风湿性关节炎滑膜组织的过度血管增生，纤维蛋白沉淀和组织炎症。
许多研究都已表明RA滑膜组织和肿瘤在组织病理学上有很多共同特征，包括：血液高凝血活性，极度的血管增生，过量的纤维蛋白沉淀和不正常的细胞凋亡。2005年，我们首次报道PADI4在各种恶性肿瘤组织中有很高的表达，尤其是在各种腺癌。Westernblot和抗瓜氨酸化蛋白抗体的免疫组化也证实了PADI4在肿瘤癌细胞中的表达。因此，我们推测肿瘤组织中AT也可能被大量表达的PADI4瓜氨酸化，并释放到血液循环中。所以，本研究旨在通过检测PADI4在肿瘤中的表达特征和表达机制，初步探讨PADI4是如何参与肿瘤的发病过程的。
研究方法：
1.应用ELISA的方法检测各种恶性肿瘤患者血液中PADI4的表达水平。
2.应用ELISA双抗体夹心方法检测各种恶性肿瘤患者血液中瓜氨酸化抗凝血酶的表达水平。
3.应用RT-PCR的方法检测PADI4mRNA在卵巢癌组织中的表达，比较其在卵巢癌组织和良性卵巢肿瘤组织的表达差异。
4.应用Taqman实时荧光定量RT-PCR的方法检测PADI4mRNA在卵巢癌组的表达量。
5.应用免疫组化的方法检测PADI4蛋白在卵巢癌组织中的表达。
研究结果：
1.PADI4在乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、食管癌、胃癌，结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌，肾细胞癌子宫癌、前列腺癌和膀胱癌各种恶性肿瘤患者血清中与对照组相比有很高的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在甲状腺癌中PADI4表达比健康血清低。在乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肾细胞癌等手术后患者血中PADI4表达明显下降。在乳腺纤维瘤、子宫肌瘤和甲状腺腺瘤中PADI4表达比健康对照组高，甚至有些比其相应恶性肿瘤中还要高。
2.cAT在乳腺癌、肝细胞癌、肺癌，食管癌、胃癌，结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺癌和前列腺癌大多数恶性肿瘤中表达很高(P＜0.05)。cAT在恶性肿瘤患者手术后表达下降。
3.PADI4和cAT在肿瘤患者血液中表达的相关性通过X2检验，在肝癌、肺癌、卵巢癌和甲状腺瘤等肿瘤中PADI4表达和cAT的表达密切相关(P＜0.01)。
4.PADI4mRNA在卵巢癌组织中有表达，良性肿瘤病变组织中未检测到PADI4mRNA的表达。
5.PADI4mRNA在卵巢癌组织中的表达量为1.57×102copies/ml，良性肿瘤病变组织中未检测到PADI4mRNA的表达。
6.PADI4蛋白在卵巢癌组织中显著表达，良性肿瘤病变组织中无表达或者微弱表达。
结论：
1.通过大量临床标本的检测，我们发现在肝癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌中PADI4和瓜氨酸化抗凝血酶大量表达，并且二者表达密切相关，表明PAID4可能通过对抗凝血酶瓜氨酸化而参与了某些肿瘤的发病过程。
2.通过RT-PCR和Taqman实时荧光定量RT-PCR方法检测了卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中PADI4mRNA的表达，发现在卵巢癌组织PADI4mRNA是高表达的，揭示了PADI4和卵巢癌之间的相关性。
3.通过免疫组化方法检测了卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中PADI4蛋白的表达，发现在卵巢癌癌细胞中PADI4蛋白是显著表达的，表明PADI4在卵巢癌发病过程中发挥了重要作用。
4.卵巢癌组织中PADI4在基因转录水平和蛋白翻译水平表达都是升高的，表明PADI4基因转录水平的异常可能导致其蛋白质表达异常，从而启动了了卵巢癌的发病过程。