氧化应激是机体产生过量的活性氧(ROS)并且超出其自身抗氧化防御系统的清除能力,氧化和抗氧化失衡的一种病理状态。大量的ROS将会攻击生物大分子,造成脂质过氧化损伤、蛋白损伤、DNA损伤以及随后的细胞凋亡。氧化应激对细胞组织造成的功能性损伤,在一定程度上与人类系统性疾病的发生和发展相关,极可能导致心血管系统疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、呼吸系统疾病和癌症等疾病的产生。因此,正如高血糖、高甘油三酯和高胆固醇等人类代谢性疾病的高危因素一样,氧化应激给人类健康带来严重影响,寻找抗氧化活性物质对于人类慢性疾病的控制和改善显得尤为重要。黄连是最常用传统中药的前50味之一,在中医治疗中,其运用具有悠久的历史。黄连的主要活性成分是小檗碱,黄连碱,巴马汀,表小檗碱以及药根碱,这五种生物碱均属于异喹啉类衍生物,仅存在取代基的不同,具有相似的化学结构,所以其生理活性也大致相似。其中,黄连碱呈现出多种药理活性,包括:抗菌、保护胃黏膜,抗高胆固醇血症,抗高甘油三酯血症,抗肥胖和抗氧化。有关黄连碱的抗氧化活性,仅仅报道了其在体外的自由基清除活性以及体内对氧化应激标志物的改变,但是黄连碱对氧化应激动物模型的病理状态的抵抗作用以及抗氧化潜在机制仍然不清楚。因此,本课题旨在进一步探究黄连碱的抗氧化活性及其潜在的作用机制,为黄连的综合开发利用提供理论基础。同时,对黄连碱的活性研究需要进行材料准备,本课题旨在采用化学合成的方法来批量生产黄连碱,通过优化合成工艺,提高黄连碱合成收率并得到高纯度的终产物,作为其药理活性研究的原料来源。本课题的主要内容和结果如下:(1)以2,3-二羟基苯甲醛为起始原料,经环合、缩合和闭环三步反应得到目标化合物黄连碱。主要的优化在于第二步反应采用甲醇重结晶法代替硅胶柱层析法进行分离纯化,以及第三步设计不同酸性性质和酸性强度的反应介质,从而筛选得到最佳反应条件,显著提高了黄连碱全合成的收率,缩短了反应时间,并在最后的纯化操作省去了调pH的操作。我们最终选择甲酸加5%的磷酸(甲酸体积:磷酸体积=1:5%)作为最后一步的反应溶剂,于90℃反应3小时得产量较高的黄连碱,总收率由原文献的13.7%提高到43.0%,且纯度高达98.5%。(2)初步探究黄连碱对AAPH诱导的氧化应激斑马鱼胚胎的抗氧化作用。结果发现氧化应激诱导剂AAPH显著增加斑马鱼胚胎的ROS产生、心跳速率、脂质过氧化和细胞死亡。然而给予黄连碱治疗后,发现其针对这些病理状态具有良好的抵抗作用。尤其是高剂量黄连碱能有效减少ROS产生、降低心跳速率、抑制脂质过氧化和细胞死亡,其抵抗作用使得各指标分别较模型组显著降低了41.3%(p<0.01),24.9%(p<0.01),26.5%(p<0.01),30.0%(p<0.01)。(3)采用qRT-PCR方法,探索黄连碱对AAPH诱导的氧化应激斑马鱼胚胎的抗氧化机制中发现,AAPH诱导的氧化应激使得斑马鱼胚胎中抗氧化相关基因(NQO1、Nrf2、Akt、JNK、p38和ERK)的mRNA表达较正常组显著降低。然而10μg/mL的高剂量黄连碱作用后,能够显著上调抗氧化相关基因的表达。与模型组相比,NQO1、Nrf2、Akt、JNK、p38和ERK的mRNA表达分别被黄连碱提高了44.9%(p<0.05),75.8%(p<0.01),50.0%(p<0.01),31.1%(p<0.01),16.3%(p<0.05)和34.7%(p<0.01)。这说明黄连碱能够在转录水平上增加抗氧化相关靶标的基因表达,从而发挥抗氧化活性。(4)探究黄连碱对AAPH诱导的HepG2细胞氧化应激的抗氧化作用。结果显示,AAPH的刺激导致了HepG2细胞中ROS显著增加、GSH含量显著减少、SOD和GPx活力显著降低。而黄连碱能够较显著抑制ROS的产生,提高内源性抗氧化剂GSH含量以及抗氧化酶SOD和GPx的活力,从而发挥抗氧化活性。高剂量黄连碱降低ROS、增加GSH含量以及提高SOD和GPx活力分别较模型组达40.1%(p<0.01),19.8%(p<0.01),18.3%(p<0.05),49.3%(p<0.01)。(5)采用western blot法,进一步探讨了黄连碱对AAPH诱导的HepG2细胞氧化应激的抗氧化机制。数据显示,处于氧化应激的HepG2细胞,其NQO1、Nrf2、p-Akt和p-JNK的蛋白表达水平较正常组显著降低,而高剂量黄连碱干预后,上述靶标的蛋白表达分别较模型组极显著地上调了117.2%,34.6%,358.8%,221.1%。同时,高剂量黄连碱能促进Nrf2的核迁移。我们得出,黄连碱通过促使Akt和JNK信号的磷酸化来激活这两种上游靶标,也通过促进Nrf2的蛋白表达和核迁移来激活Nrf2及其后续的信号转导,最终诱导NQO1的表达。最后,采用上游激酶(Akt、JNK、p38和ERK)的相应抑制剂与黄连碱共处理,我们发现Nrf2/NQO1通路的激活依赖于上游Akt和JNK信号的活化,即Akt和JNK与Nrf2/NQO1通路存在级联关系。总之,本研究优化了黄连碱的合成工艺,提高了黄连碱合成总收率并得到高纯度的黄连碱终产物。黄连碱通过激活Akt和JNK/Nrf2/NQO1通路来发挥抗氧化活性,主要表现为清除ROS、降低心跳速率、抑制脂质过氧化和细胞死亡、增加GSH含量以及提高SOD和GPx活力。