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SMYD3(SET and MYND domain-containing protein3)是一种 H3K4 甲基化转移酶,属于SMYD的家族成员。据报道,过表达SMYD3基因可促进牛体细胞重编程,提高牛胎儿成纤维细胞诱导形成iPSCs的效率。为探究SMYD3基因在猪体细胞重编程过程中的作用,本研究采用RNA干扰(RNAi)和过表达等技术方法,通过调控德保猪耳成纤维细胞SMYD3基因的表达,探讨其在猪体细胞核移植过程中的重编程作用,为提高猪体细胞克隆的效率奠定基础。一、猪SMYD3基因表达载体构建及其shRNA干扰效率验证1.猪SMYD3基因编码区序列克隆与pLVX-IRES-Zsgreen1 SMYD3真核表达载体构建。克隆的猪SMYD3基因片段为1404 bp,经生物信息学分析发现其与猪SMYD3基因同源性为99%,与羊、牛SMYD3基因的同源性均为93%。细胞转染试验结果显示,构建的SMYD3基因表达载体能在293T细胞中表达。2.根据文献报道的其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3shRNA1/2 表达载体,转染 293T 细胞,利用 qRT-PCR分析干扰效率。结果显示,SMYD3基因shRNA1/2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%。选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。二、SMYD3基因表达对猪成纤维细胞增殖的影响为研究SMYD3基因表达对猪成纤维细胞增殖的影响,首先分别包装过表达SMYD3基因及其shRNA的慢病毒,以不同MOI值病毒感染猪成纤维细胞,选出较适MOI,测定生长曲线;收集各组成纤维细胞,检测细胞SMYD3、Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖;抑制SMYD3基因表达的细胞增殖受到抑制。qRT-PCR结果显示,SMYD3、Nanog和DNMT1基因在过表达SMYD3基因猪成纤维细胞中表达显著升高(P<0.05);在下调SMYD3基因细胞中表达显著降低(P<0.05)。三、SMYD3基因表达对猪体细胞核移植胚胎发育影响及初步机理分析首先分析SMYD3基因在体外成熟猪卵母细胞、孤雌激活和核移植早期胚胎中的表达模式,并探讨在供体成纤维细胞中调控SMYD3基因表达对猪核移植早期胚胎发育及多能性基因表达的影响。qRT-PCR结果显示,SMYD3基因在猪卵母细胞体外成熟过程中表达较低;在孤雌激活和核移植早期胚胎发育过程中均呈现先升高后降低的表达规律,其中在4细胞和8细胞期胚胎中表达较高。过表达SMYD3基因显著提高猪核移植胚胎的囊胚率(14.63%vs 9.68%,P<0.05),下调SMYD3基因表达显著降低囊胚率(6.74%vs 9.68%,P<0.05)。上调SMYD3组猪核移植囊胚Nanog和Oct4基因表达水平显著提高(P<0.05);下调组囊胚Nanog基因检测不到,Oct4基因表达无显著差异。以上结果表明,SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖和重编程能力显著相关,上调其表达可提高猪成纤维细胞的增殖能力及其随后的核移植胚胎体外发育能力。