【摘 要】
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干扰素(Interferon, IFN)-γ是被发现最早,研究最多的细胞因子。IFN-γ除了具有抗病毒和抗肿瘤活性外,还具有上调MHCII类抗原的表达、促进抗原提呈等免疫调节活性[1]。为了建
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干扰素(Interferon, IFN)-γ是被发现最早,研究最多的细胞因子。IFN-γ除了具有抗病毒和抗肿瘤活性外,还具有上调MHCII类抗原的表达、促进抗原提呈等免疫调节活性[1]。为了建立猪γ-干扰素的检测方法,研究机体的免疫状态及免疫机制,为猪传染病的免疫学诊断提供新方法,本研究进行了该基因的表达、纯化和单克隆抗体的制备及鉴定。首先,将含有猪IFN-γ基因的PET-32a-PoIFN-γ和PGEX-4T-1-PoIFN-γ的重组菌BL21分别培养,经IPTG诱导表达,得到分子量约35.0KD和43.0KD的融合蛋白。在SDS-PAGE图中,融合蛋白His-PoIFN-γ分子量为35KD大小,该融合蛋白主要以包涵体形式表达。经超声裂解包涵体和透析复性后,获得较纯的目的蛋白,作为免疫抗原。融合蛋白GST-PoIFN-γ分子量约为43KD大小,其中GST大小为26KD。该蛋白经GSTrapFF亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳显示为单一蛋白条带,纯化效果较好,作为ELISA检测中的包被抗原,含空载体的BL21菌培养诱导,超声裂解复性后作为筛选抗原。融合蛋白His-PoIFN-γ腹腔注射免疫8周龄BALB/C小鼠,100μg/只,加强免疫三天后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。分别以纯化的重组蛋白GST-PoIFN-γ及空载体诱导后裂解物为包被抗原,用间接ELISA筛选阳性克隆,经有限稀释法3次亚克隆后,最终获得一株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,命名为B3株。分别采用Dot-ELISA和Western-blot鉴定该株单抗的特异性。结果显示B3株单抗只与His-PoIFN-γ和GST-PoIFN-γ反应,而与空载体表达产物、His-ChIFN-γ、GST-ChIFN-γ、His-F及GST-E2等非相关蛋白均无交叉反应,表明该株单抗是针对猪IFN-γ基因的特异性单抗。采用体内诱生腹水法制备McAb腹水,单抗腹水的间接ELISA效价在1:160000以上。进一步用鼠源抗体亚型鉴定试剂盒,对B3株McAb进行亚型鉴定。结果表明,B3株为IgG1型,其轻链为κ链。综上所述,本研究成功地将原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21菌中,完成了原核蛋白的表达和纯化,并制备出了针对PoIFN-γ蛋白的特异性McAb,它将在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面具有重要的应用价值,对于进一步研究猪传染性疾病具有十分重要的现实意义。
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