研究背景在缺血性视网膜疾病中,多种视网膜细胞分泌大量VEGF。它不仅能促进新生血管形成、增加血视网膜屏障通透性,还对各种视网膜细胞产生一定影响。尽管VEGF抑制剂已应用于临床,但是其对某些视网膜细胞作用的机制尚不清楚,如VEGF对Müller细胞的影响。Müller细胞是视网膜中主要的胶质细胞,在维持视网膜正常结构、代谢及功能方面起着重要作用。在缺血性视网膜疾病中,Müller细胞会反应性增生,这与多种视网膜细胞分泌的多种细胞因子刺激有关。我们研究缺氧条件下和外源性VEGF对Müller细胞的影响。目的1.用CoCl2建立Müller细胞化学缺氧模型,观察缺氧对大鼠Müller细胞活性的影响。2.观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)对大鼠Müller细胞活性的影响。方法1. Müller细胞培养与鉴定:出生1 wk以内SD大鼠,分离并剪碎视网膜组织,胰蛋白酶消化,将含有混悬细胞的消化液通过53μm尼龙筛网过滤后,收集滤液,获得混合游离细胞,加入20%胎牛血清培养液中培养,3 d换液。改良酶消化法纯化细胞2～3遍,按1:2比例传代,传至第2～3代后采用GFAP和谷氨酰胺合成酶(GS)抗体免疫组化染色方法鉴定。2.氯化钴法建立Müller细胞化学缺氧模型:将经纯化鉴定传至3~5代融合前的Müller细胞培养24 h后置于含有200μM CoCl2的培养液内培养0、4、8、12、16、20和24 h,采用MTT[3(4,5 dimethylthiazole 2yl) 2,5 diphenyl tetrazolium bromide]比色法检测细胞增生活性,免疫细胞化学法和积分吸光度(IA)检测GFAP、VEGF、Flt-1和Flk-1的表达,TUNEL法检测细胞凋亡,观察缺氧对Müller细胞的影响。3.不同浓度VEGF对缺氧Müller细胞的影响:在缺氧24 h之前加入10、25、50、75和100μg/L VEGF,继续培养24 h,采用MTT法和TUNEL法检测。4. 75μg/L VEGF对不同缺氧时间下Müller细胞的影响:缺氧前加入75μg/L VEGF培养24 h,再置于含有200μM CoCl2的培养液中培养0、4、8、12、16、20和24 h,采用MTT法和TUNEL法检测。5. SU1498对Müller细胞的影响:缺氧前24 h时加入75μg/L VEGF,同时加入700μg/L SU1498,采用MTT法和TUNEL法检测。结果1.酶消化法纯化后剩下的细胞多数为Müller细胞。第3代的Müller细胞经GFAP和谷氨酰胺合成酶染色鉴定其纯度为90%,活力是87.3%。2. Müller细胞的GFAP染色在缺氧后增强(P<0.05)。缺氧后0、4、8、12、16、20和24 h时IA分别为1933±79、2005±98、2451±87、2396±86、2092±129、1892±63和1659±55。12 h后可观察到细胞肿胀、脱落,但16 h时细胞活力仍为83%。VEGF缺氧后表达量呈持续上升趋势(P<0.01),于24 h达到48.4±1.4。常氧下Flk-1和Flt-1表达量分别为2.3±0.5和2.0±0.7。但缺氧后4、8、12、16、20和24 h时Flk-1和Flt-1表达量分别为2.3±0.5、4.1±0.2、5.1±2.3、10.3±3.1、12.5±3.3、17.2±3.2、18.4±3.4和2.0±0.7、4.2±1.5、17.4±1.5、25.4±2.3、30.2±1.8、31.6±2.2、33.5±1.9。24 h时细胞增生活性(A)降低到72.7%,而细胞凋亡指数增加了8.2倍。3.细胞在缺氧前24 h时加入VEGF,终浓度为50、75、100μg/L的VEGF对细胞有明显促增生作用,细胞活性增加,凋亡减少,并呈剂量依赖性。75μg/LVEGF作用后细胞活性达0.201±0.031,凋亡指数达12±1.2;100μg/LVEGF作用后细胞活性达0.199±0.007,凋亡指数达11±1.5。与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),但两者之间差异不显著(P>0.05)。添加75μg/L VEGF后经不同时间缺氧,与对照组相比,细胞数增多,活性增强,凋亡指数下降,缺氧24 h时细胞活性增强了1.3倍,凋亡指数下降到2/3。4. VEGF+SU1498组和VEGF组缺氧24 h后细胞活性分别为0.129±0.002和0.168±0.005,凋亡指数分别为14±1.8和12±1.5。与未加VEGF、SU1498的对照组相比,SU1498明显抑制了VEGF对Müller细胞的作用(P<0.05)。结论1.短时间缺氧首先刺激Müller细胞增生,活性增加,随着缺氧时间延长,细胞受到损伤,部分细胞肥大肿胀死亡,活性降低,凋亡指数增加,GFAP、VEGF及其受体(Flk-1、Flt-1)的表达增加并呈时相依赖性。2.缺氧前加入不同浓度VEGF能够促进Müller细胞增生,活性增强,凋亡指数下降,并呈浓度依赖性,说明VEGF对缺氧的Müller细胞有保护作用,这种保护机制可能由受体Flk-1介导。本实验创新点:初步探索了VEGF对缺氧条件下大鼠Müller细胞的影响及机制,该研究在国内外未见报道。