论文部分内容阅读
有氧糖酵解作为肿瘤细胞特有的一种代谢模式,成为抗肿瘤治疗研究的热点。但是,许多研究发现,肿瘤细胞能够在有氧糖酵解受损时存活下来。除了有氧糖酵解之外,“谷氨酰胺成瘾”是肿瘤细胞代谢的第二大特点。在肿瘤细胞中谷氨酰胺产生的谷氨酸具有多种代谢途径,包括被肿瘤细胞排出胞外以换取胱氨酸,参与生成抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione,GSH)以及转化为α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)供能。研究表明,胶质瘤细胞的有氧糖酵解与谷氨酰胺代谢具有协同效应以满足肿瘤细胞对生物能和生物合成的需求。因此,更好地理解肿瘤细胞有氧糖酵解与谷氨酰胺代谢之间的关系可能会找到新的治疗方案。在本研究中,我们发现抑制神经胶质瘤细胞糖酵解或剥夺葡萄糖,谷氨酸外排异常增加。我们进一步发现,抑制糖酵解或葡萄糖饥饿会诱导谷氨酸/胱氨酸反向转运蛋白xCT(glutamate/cystine antiporter xCT或SLC7A11)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamate cysteine synthase,γ-GCS)过表达,产生更多的还原型GSH,以调节氧化还原平衡。最后,我们的研究表明抑制糖酵解的同时抑制xCT或γ-GCS可以有效地阻断GSH的产生,并引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)上调,从而更好地抑制神经胶质瘤细胞的增殖。总之,我们的结果表明葡萄糖代谢受损时谷氨酸代谢通过氧化还原调节促进神经胶质瘤细胞的存活,并且证实阻断谷氨酸参与的氧化还原途径可以改善靶向糖酵解的治疗效果。主要结果如下:1.采用邻苯二甲醛(Ophthalaldehyde,OPA)柱前衍生化法,利用紫外分光光度计全波长扫描确定了谷氨酰胺、谷氨酸的最佳检测波长为335nm。然后利用HPLC检测了谷氨酰胺、谷氨酸的标准品,发现谷氨酰胺和谷氨酸的出峰时间分别是7.3 min和5.5 min,且浓度和峰面积成正相关;2.利用2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)或草氨酸钠(Oxamate,Oxa)抑制糖酵解或葡萄糖剥夺处理胶质瘤U251,U87细胞,通过检测胞外的乳酸分泌和葡萄糖消耗发现2-DG,Oxa处理胶质瘤细胞24小时的半抑制浓度均为15mM。HPLC检测胞外谷氨酸的含量,结果显示抑制糖酵解或剥夺葡萄糖之后,U251,U87细胞的谷氨酸外排显著增加;3.qPCR和Western blot技术检测谷氨酸代谢途径中关键分子的变化,结果显示糖酵解阻断条件下调节谷氨酸参与氧化还原平衡的xCT和γ-GCS转录水平和蛋白水平均高表达,分解谷氨酸参与三羧酸循环的谷氨酸脱氢酶转录水平没有显著变化且活性相对降低;4.通过检测胶质瘤细胞中GSH和ROS的含量证实抑制糖酵解或剥夺葡萄糖时,谷氨酸参与胞内的GSH合成从而降低ROS水平保证细胞存活。糖酵解抑制剂联合xCT的抑制剂柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SSZ)在450μM或γ-GCS的抑制剂丁硫氨酸亚砜亚胺(Buthionine sulfoximine,BSO)在1mM,相比各抑制剂单独作用时显著抑制了胶质瘤细胞活力。