肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, SE)是一类寄生于人和动物肠道内革兰氏阴性无芽孢直杆菌,绝大多数有鞭毛能运动。肠炎沙门氏菌不仅能够引起肉鸡生长迟缓,蛋鸡产蛋量下降,死亡,造成严重的经济损失,而且还会间接引起食用感染鸡的蛋及肉制品的人食物中毒,是重要的人兽共患病原体,具有重要的公共卫生学意义。肠炎沙门氏菌的致病性与其毒力因子密切相关,这些毒力因子通过不同致病机制共同作用于宿主,引起宿主机体损害。菌毛是肠炎沙门氏菌的重要毒力因子之一。肠炎沙门氏菌表达多种菌毛结构,在感染早期它能够影响细菌对宿主靶组织的定植和粘附,也可以通过与宿主细胞表面的受体的特异性结合引起各种应答反应。肠炎沙门氏菌SEF21(Ⅰ型)菌毛广泛分布于沙门氏菌属,而SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌和都伯林沙门氏菌表面,本试验以SEF21、SEF14菌毛为研究对象,构建SEF21菌毛亚单位缺失株及SEF21、SEF14菌毛亚单位双缺失株,通过体外细胞试验及易感动物感染试验比较分析SEF21菌毛与SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌感染过程中的作用,旨在揭示肠炎沙门氏菌与宿主相互作用的分子机制,为肠炎沙门氏菌的防控提供理论依据。1利用Red同源重组技术构建SEF21菌毛主要亚单位编码基因缺失株根据GenBank中已经报道的S. enteritidis SEF21菌毛主要亚单位蛋白编码基因fimA的序列,首先合成一对引物(每一条引物5’端与fimA基因同源,而3’端与pKD3质粒上氯霉素抗性基因cat同源),经PCR扩增后得到具有氯霉素抗性基因和同源臂的产物,将PCR扩增产物直接转化入肠炎沙门氏菌中,在pKD46表达的重组酶的作用下,PCR产物两端的fimA基因同源序列与肠炎沙门氏菌染色体上的的同源序列发生同源重组交换,利用抗性筛选得到阳性一次重组菌。利用编码Flp重组酶的质粒pCP20,去除氯霉素抗性基因,最后在染色体上只留下一个FRT位点,得到二次重组菌,通过PCR扩增及测序鉴定突变株的正确构建。本试验成功构建了肠炎沙门氏菌国内标准株50336、国际标准株994的fimA基因缺失株,并在实验室保存的SEF14菌毛亚单位缺失株50336As△sef4、994△sefA的基础上构建了双缺失突变株△sefA△fimA2株。上述缺失株的成功构建,为进一步深入研究SEF21、 SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌感染过程中的独立或协同作用,及如何有效控制肠炎沙门氏菌污染禽蛋产品奠定了一定的基础。2SEF21与SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中作用初探为了进一步研究SEF21和SEF14菌毛对肠炎沙门氏菌致病性的影响,我们将表达sefA基因的pBR322质粒和表达fimA基因的pACYC184质粒转化入相应的单基因或双基因缺失株,构建了互补株。基于野生株50336、994,缺失株X△sefA、X△fimA、X△sefA△fimA及相应互补株的基础上,分别进行了人结肠癌细胞系Caco-2勺粘附作用,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验及腹腔巨噬细胞内存活试验。各野生株、缺失株和相应回补株于CFA培养基中静置培养48-50h,使SEF21、SEF14菌毛充分表达,以感染复数为100的细菌悬液感染Caco-2细胞,细菌与细胞共孵育1h,试验结果表明,X△sefA、X△fimA单缺失株与野生株在粘附数量上差异不显著,但X△sefA△fimA双缺失株的粘附数量则明显下降。同等条件下进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和存活试验,选取感染1h和4h为时间点,试验结果表明,随着时间的增加,小鼠腹腔巨噬细胞对所有野生株、突变株和回补株的吞噬作用加强,且对X△fimA和X△sefA△fimA的吞噬作用尤为显著,但与X△sefA不同,其在活化的小鼠腹腔巨噬细胞内的存活能力降低。上述结果可能意味着肠炎沙门氏菌与肠上皮细胞的粘附作用尽管受某一特定因子的单一作用影响,但需要多种菌毛结构或粘附因子的共同作用。SEF14菌毛与SEF21菌毛都可能影响肠炎沙门氏菌与巨噬细胞的相互作用,两者的存在更有利于肠炎沙门氏菌侵入巨噬细胞并在巨噬细胞内生长繁殖,导致宿主隐性感染和长期排毒。3肠炎沙门氏菌及其菌毛突变株对BaIb/c小鼠的感染试验将6周龄Balb/c小鼠分成一个对照组和7个攻毒组,经腹腔注射途径分别对各攻毒组试验小鼠接种10、102、103cfu剂量的肠炎沙门氏菌50336和突变株50336△sefA、50336△fimA、50336△sefA△fimA及相应互补株,观察攻毒后试验组小鼠的临床变化和死亡情况,对死亡小鼠进行细菌学鉴定。测定半数致死量结果显示肠炎沙门氏菌50336和突变株50336△sefA、50336△fimA、50336△sefA△fimA及相应互补株对6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为10.50cfu,8.06cfu,14.38cfu,16.77cfu,11.90cfu,11.90cfu,10cfu,说明SEF21菌毛与SEF14菌毛对肠炎沙门氏菌致病力的影响不一,突变株50336△sefA增强肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的毒力,而突变株50336△fimA则减弱肠炎沙门氏菌毒力,双突变株50336△sefA△fimA毒力降低的原因可能是由于其对肠上皮细胞的粘附能力下降同时又易被巨噬细胞清除有关。肠炎沙门氏菌及其突变株感染小鼠后,细菌侵害多个脏器,分布广泛,细菌鉴定结果表明,小鼠肝、肾、脾、肺、盲肠及小肠中都可成功分离到攻毒菌株。根据肠炎沙门氏菌以及相应菌毛突变株对Balb/c小鼠的感染试验,进一步验证了肠炎沙门氏菌不同菌毛结构对其致病性的影响,SEF21菌毛可能在肠炎沙门氏菌抵抗易感宿主巨噬细胞杀伤作用方面起到关键作用,而在SEF14菌毛的作用下,肠炎沙门氏菌能够更好的作用于巨噬细胞并能在其中生长繁殖,可能是肠炎沙门氏菌隐性感染和长期排毒的重要原因,而双缺失株对易感动物的致病性大大降低,这为控制肠炎沙门氏菌感染提供理论依据。