本文从以下两部分进行了阐述。　　第一部分RANKL介导Ghrelin抑制血管平滑肌细胞成骨样分化的机制研究。　　第一章Ghrelin下调RANKL在小鼠血管平滑肌细胞的表达。　　目的:观察核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator fornuclear factor-κBligand，RANKL)在小鼠血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)成骨样分化过程中的表达，以及Ghrelin对RANKL表达的影响。　　方法:分离小鼠的原代VSMCs，细胞免疫化学法及Western blot法检测平滑肌肌动蛋白α(smooth muscleα-actin，SMα-actin)，鉴定其细胞表型;使用10mMβ-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate，β-GP)诱导小鼠原代VSMCs向成骨样细胞分化，以10-6～10-8M的Ghrelin干预β-GP诱导的小鼠VSMCs，Western blot分析法检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2，Runx2)蛋白的表达;荧光定量PCR(polymerase chain reaction)检测RANKL、Runx2、骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）mRNA的表达;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测RANKL蛋白的分泌量;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒检测ALP活性;茜素红染色观察矿化结节的形成情况。　　结果:(1)成功分离了小鼠原代VSMCs，细胞免疫化学法及Westernblot结果显示SMα-actin表达阳性;　　(2)β-GP可显著增加Runx2和BMP-2的表达，增强ALP活性，促进矿化结节形成;在β-GP诱导的小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的过程中RANKL mRNA和蛋白的表达量均显著增加;　　(3)10-6～10-8M的Ghrelin呈时间和剂量依赖性抑制ALP活性和RANKL表达。　　结论:成功分离了小鼠原代VSMCs，并构建VSMCs向成骨样细胞分化的体外细胞模型;Ghrelin抑制VSMCs向成骨样细胞分化，并下调RANKL的表达。　　第二章RANKL介导Ghrelin抑制小鼠血管平滑肌细胞的成骨样分化。　　目的:探讨RANKL在Ghrelin抑制小鼠VSMCs成骨样分化中的作用。　　方法:构建RANKL过表达质粒，以RANKL过表达质粒转染小鼠VSMCs，使用Ghrelin干预过表达RANKL的小鼠VSMCs。荧光定量PCR检测RANKL、Runx2 mRNA的表达，ALP试剂盒检测ALP活性。　　结果:(1) RANKL过表达质粒可显著增加RANKL的表达;　　(2) RANKL过表达后，Ghrelin抑制ALP活性和Runx2表达的作用消失，说明RANKL阻断了Ghrelin抑制VSMCs向成骨样细胞分化的作用。　　结论:RANKL介导了Ghrelin抑制VSMCs的成骨样分化。　　第三章Ghrelin抑制小鼠血管平滑肌细胞成骨样分化的机制研究。　　目的:研究Ghrelin抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的作用机制。　　方法:以10-6M的Ghrelin干预小鼠VSMCs，提取细胞总蛋白和磷酸化蛋白，行Western blot并观察5～60min不同时间点促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/Akt（PI3K/Akt）磷酸化蛋白的表达;结合 ERK通路阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002，检测ERK和Akt信号通路阻断后，RANKL、Runx2表达和ALP活性的变化，进一步探讨Ghrelin抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的作用机制。　　结果:(1) Ghrelin激活p-ERK和p-Akt的表达，但对P38和JNK磷酸化没有激活作用;　　(2) ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002均可阻断Ghrelin抑制RANKL与Runx2的表达和ALP的活性。　　结论:Ghrelin通过ERK/RANKL和Akt/RANKL信号通路抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化。　　第二部分Ghrelin抑制成骨细胞MC3T3-E1凋亡的作用机制研究。　　第一章Ghrelin抑制无血清饥饿诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡　　目的:研究10-9～10-11M的Ghrelin对无血清饥饿诱导小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的影响。　　方法:以10-9～10-11M Ghrelin干预小鼠成骨细胞MC3T3-E1，分别以TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotinnick end labeling)法和ELISA法检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达以及caspase-3的分泌。　　结果:(1) l0-9～10-11M的Ghrelin呈剂量依赖性抑制无血清饥饿诱导的MC3T3-E1细胞凋亡;　　(2)10-9～10-11M的Ghrelin呈剂量依赖性促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达以及caspase-3分泌。　　结论:Ghrelin抑制无血清饥饿诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡。　　第二章Ghrelin通过GHSR/ERK和GHSR/Akt信号通路抑制MC3T3-E1细胞凋亡　　目的:探讨Ghrelin抑制小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的作用机制。　　方法:RT-PCR和Western blot法检测GHSR在小鼠成骨细胞MC3T3-E1的表达。使用RNA干扰技术阻断GHSR表达。10-9M的 Ghrelin干预MC3T3-E1细胞，Western blot法检测不同时间点p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-Akt、Akt表达。联合ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002，观察Ghrelin抑制MC3T3-E1细胞凋亡的细胞信号机制。　　结果:(1) GHSR在小鼠成骨细胞MC3T3-E1表达，并且GHSR表达被GHSR-siRNA阻断;　　(2)10-9M的Ghrelin激活p-ERK和p-Akt，但不激活p-JNK和p-p38;ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002及GHSR-siRNA均可阻断Ghrelin激活ERK和Akt信号通路。　　(3) ERK和Akt信号通路被阻断或GHSR敲除后，Ghrelin抑制MC3T3-E1细胞凋亡的作用消失。　　结论:Ghrelin通过GHSR/ERK和GHSR/Akt信号通路抑制小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡。