刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生顶复门原虫,可感染几乎所有温血动物(包括人)的有核细胞。世界上约三分之一的人感染弓形虫。弓形虫生命周期的各个阶段都有广泛的研究,但对弓形虫逸出宿主细胞的作用机制知之甚少。微线体蛋白PLP1具有穿孔的功能,在弓形虫逃逸宿主细胞过程中发挥了重要作用。弓形虫CDPK1调节微线体蛋白的分泌,在弓形虫运动、入侵、逸出阶段发挥重要作用。鉴于目前缺乏针对弓形虫病的有效治疫苗,本研究旨在探究弓形虫PLP1基因生物学功能,为其深入研究奠定基础,同时为弓形虫疫苗候选抗原的筛选提供基础,开展以下试验。首先,进行了PLP1和CDPK1蛋白的表达及多克隆抗体的制备。PCR扩增截短的PLP1基因片段和截短的CDPK1基因片段,构建重组载体pET-28a(+)-PLP1和pGEX-6p-1-CDPK1进行诱导表达。PLP1蛋白以包涵体形式表达,采用KCl染色切胶法纯化重组蛋白,免疫6~8周龄昆明鼠,制备鼠多克隆抗体;CDPK1蛋白以可溶性形式表达,利用GST标签亲和层析法纯化目的蛋白,免疫8周龄新西兰兔,制备兔多克隆抗体。本研究成功获得PLP1基因和CDPK1基因的重组蛋白及多克隆抗体,为PLP1功能的研究奠定基础。为进一步研究PLP1基因的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了PLP1基因缺失(PLP1-KO)株和PLP1基因互补(PLP1-CO)株。经入侵试验、体外增殖试验、空斑试验及逸出试验发现,与RH株和PLP1-CO株相比,PLP1基因缺失不影响弓形虫入侵效率,影响体外增殖速率。但形成空斑的大小和数量显著减少,逸出宿主细胞的能力显著下降;小鼠体内致死性试验显示,腹腔接种1000个PLP1-KO株速殖子的小鼠有50%的存活率。说明PLP1基因缺失后不仅显著降低弓形虫逸出宿主细胞的能力,还显著降低弓形虫对小鼠的致死率。最后,通过检测PLP1-KO株小鼠的血清循环抗原水平和抗体水平探究感染小鼠存活的原因。感染1000个、100个PLP1-KO株的小鼠,小鼠血清循环抗原在感染后7天、10天达到峰值,且感染100个PLP1-KO株速殖子抗原水平显著低于感染1000个PLP1-KO株速殖子的小鼠。进一步检测抗体水平发现,两个感染剂量下,小鼠的抗体水平上升趋势一致,感染后20天内,抗体水平持续升高。说明感染1000个速殖子后,由于感染虫体基数大,在感染7天后,虫体数已达高峰,此时,部分小鼠因未产生足够的抗体抵御弓形虫而死亡。但感染100个速殖子的小鼠,由于感染基数小,小鼠机体的免疫力可抑制弓形虫在体内的增殖,且随着抗体水平的增加逐渐清除弓形虫,因此其存活率(80%)较感染1000个PLP1-KO株的小鼠高。表明PLP1基因缺失株对小鼠的致死率与初始感染剂量和小鼠本身的免疫力均有密切关系。