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目的:神经胶质细胞瘤是颅内最严重和致命的恶性肿瘤之一,目前传统的疗法对胶质瘤的治疗预后并不理想,一般认为恶性程度级别越高,预后越差。GREM1是一种分泌型糖蛋白,它有助于维持肿瘤的等级。有研究报道GREM1在胶质瘤肿瘤干细胞中有分泌,过表达,GREM1能够显著促进胶质瘤干细胞的增殖和成瘤能力,干扰GREM1表达能够抑制胶质瘤干细胞的增殖和自我更新能力。GREM1还被报道能够通过激活其下游TGF-β1/Smad信号通路促进EMT(Epithelial Mesenchymal Transdifferentiation)。相关研究已经证实了EMT可以促进多种肿瘤的迁移与侵袭能力。因此,目前EMT与各类肿瘤的关系的相关研究越来越多。本实验采用GREM1干扰质粒稳定转染人胶质瘤细胞,对其在胶质瘤的增殖和转移中起的作用进行研究,进一步探讨TGF-β1/Smad通路在GREM1致胶质瘤发生,侵袭转移中起的作用。方法:1、临床上选取30例胶质瘤患者的病理标本,记录相应患者的基本信息,并对病理标本进行免疫组化法检测GREM1的表达情况,并与相应的基本信息(年龄、级别、性别等)通过统计学方法,分析哪项条件与GREM1免疫组化的表达相关。2、(1)设计并合成GREM1基因的干扰片段和无关序列片段,将上述片段分别构建至质粒中,获得相应的的干扰质粒和无关序列NC质粒,将质粒转染人胶质瘤细胞,经筛选后,获得稳定转染的干扰细胞系和无关序列NC细胞系;并通过Real-time PCR,western blot验证GREM1基因敲减效率。(2)通过MTT实验检测细胞增殖情况和细胞的活力,并对相应的三组细胞进行流式细胞术检测细胞周期的变化,克隆形成实验检测体外成瘤能力以验证GREM1基因干扰后,人胶质瘤细胞相关情况的变化。(3)通过流式细胞术AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡;Hoechst染色检测凋亡细胞核变化;Western blot检测cleaved-caspase-3,cleaved-PARP,bcl-2,bax的表达水平以检测GREM1基因干扰对人胶质瘤细胞凋亡的影响。(4)通过划痕实验(0h,24h,48h)检测细胞迁移能力;Transwel(Matrigel基质胶)检测细胞侵袭能力;Western blot和明胶酶谱法检测MMP2,MMP9的表达以检测GREM1基因干扰对人胶质瘤细胞迁移、侵袭的影响。3、(1)Western blot检测E-cadherin,N-cadherin蛋白表达水平以检测GREM1基因干扰后人胶质瘤细胞EMT的水平。(2)Western blot检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3,BMP-7表达;免疫荧光检测smad2/3核移位以检测GREM1基因干扰后TGF-β1/smad通路激活情况。(3)10 ng/ml的TGF-β1处理人胶质瘤48h后(PMID:10048979),western blot检测p-Smad2,p-Smad3表达;(细胞分组:U87,NC,GREM1干扰,GREM1干扰+TGF-β1,U87+TGF-β1,NC+TGF-β1,以下实验均按此分组进行),10 ng/ml的TGF-β1处理人胶质瘤48h后,western blot检测E-cadherin,N-cadherin蛋白表达水平;10 ng/ml的TGF-β1处理人胶质瘤48h后,Transwel(Matrigel基质胶)实验检测细胞侵袭能力。本组实验为检测激活TGF-β1诱导smad通路激活对胶质瘤细胞侵袭及EMT的影响。结果:1、通过对该30例患者病理标本的GREM1免疫组化实验,结果表明此30例患者都有表达,强弱不一致,通过对免疫组化结果的分析,应用秩和检验法,表明GREM1基因的表达情况于年龄、性别等无关,与患者的胶质瘤级别相关。本次免疫组化实验证实高级别胶质瘤的GREM1表达要高于低级别胶质瘤的表达。2、(1)MTT实验表明在72小时、96小时和120小时时,GREM1干扰组的细胞活性明显降低,有统计学意义(P<0.05)。克隆形成实验表明GREM1干扰组的克隆形成率为(17.8±3.0%),显著低于另外两组(40.8±6.0%为U87组37.3±5.6%为NC组),有统计学意义(P<0.05)。(2)Transwell实验GREM1干扰组穿过Matrigel胶的细胞数量(52.60±5.86)明显低于其他两组(82.00±9.80为U87组80.40±10.24为NC组),有统计学意义(P<0.05)。划痕实验表明GREM1干扰组的细胞的迁移能力在24小时(17.08±2.78)和48小时(40.34±5.66)明显低于其他两组(29.61±2.73,65.84±7.20为U87组31.87±3.12,68,92±5.24为NC组),均有统计学意义(P<0.05)。(3)Western blot检测中灰度分析显示GREM1干扰组的cleaved-caspase-3,cleaved-PARP,bax的表达明显高于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。而bcl-2,MMP2,MMP9的表达明显低于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。(4)流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡实验显示,GREM1干扰组的G1期停留比例较其他两组明显增多(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。GREM1干扰组的凋亡率较其他两组明显增多(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。Hoechst染色实验显示GREM1干扰组的凋亡细胞数明显多于其他两组(U87组和NC组)。3、(1)Western blot检测中灰度分析显示GREM1干扰组的E-cadherin的表达明显高于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。而N-cadherin的表达明显低于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。(2)Western blot检测中灰度分析显示GREM1干扰组的BMP-7的表达明显高于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。而TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的表达明显低于其他两组(U87组和NC组),有统计学意义(P<0.05)。而Smad2、Smad3的表达三组均无明显差别。免疫荧光检测smad2/3核移位提示GREM1干扰组的核移位情况明显少于其他两组(U87组和NC组)。(3)10 ng/ml的TGF-β1处理人胶质瘤48h后,Western blot检测中灰度分析显示GREM1干扰+TGF-β1组的p-Smad2、p-Smad3、N-cadherin的表达值明显高于GREM1干扰组,有统计学意义(P<0.05),E-cadherin的表达值明显低于GREM1干扰组,有统计学意义(P<0.05)。而与U87组和NC组无统计学差别。Transwell实验中GREM1干扰+TGF-β1组穿过Matrigel胶的细胞数量明显高于GREM1干扰组,有统计学意义(P<0.05),但仍少于U87组和NC组,有统计学意义(P<0.05)。结论:通过对该30例患者病理标本的GREM1免疫组化实验发现,在胶质瘤患者中GREM1普遍表达,而在正常脑组织和脊髓组织中,GREM1免疫组化表达阴性居多。故我们推测GREM1可能与胶质瘤的发生相关。通过统计学分析证明,其在病理标本中的免疫组化表达程度与患者所患的胶质瘤级别相关。高级别的胶质瘤(III、IV级)表达强度高于低级别的胶质瘤。与年龄、性别等无关。GREM1的免疫组化表达强度和肿瘤的级别相关,其很可能是维持胶质瘤级别的重要因素之一。在U87细胞系中,干扰GREM1表达可显著降低胶质瘤细胞的增殖能力,促进细胞的凋亡,降低细胞的迁徙和转移能力。说明GREM1本身可以提高胶质瘤细胞的增值能力,降低细胞的凋亡率,促进细胞的迁徙和转移。GREM1在胶质瘤中很可能依靠上述的作用维持了高级别胶质瘤的恶性程度和级别。本研究同时发现干扰GREM1可抑制胶质瘤细胞EMT(Epithelial-MesenchymalTransition)。EMT是恶性肿瘤增殖,转移,侵袭等的重要原因。通过经典的TGF-β1/Smad信号通路激活实验,证明GREM1在胶质瘤细胞中可以激活TGF-β1/Smad信号通路。其可能的信号通路是GREM1在拮抗BMP通路的同时,激活TGF-β1/Smad信号通路,从而促进EMT进程,进而促进胶质瘤细胞的增殖,促进胶质瘤细胞的迁徙和转移。激活TGF-β1/Smad信号通路,促进了EMT进程只是GREM1影响胶质瘤细胞迁移和侵袭功能的一部分,而不是全部。