背景国际疼痛研究协会(The International Association for the Study of Pain,IASP)将疼痛定义为伴随着组织损伤或潜在的组织损伤并由这种损伤引起的一种不愉快的感觉和情绪体验。慢性疼痛是超过正常组织愈合时间(三个月)的疼痛。这类疼痛常常在一定的期间(数月至数年)内反复发作。这种慢性疼痛给患者的生活带来极大的痛苦,大大地降低了患者的生活质量。这种慢性、持续的疼痛是病人就医的最常见的原因,因此,临床上对慢性疼痛的治疗日益重视,然而,目前常用的治疗疼痛的药物或手段存在一定的缺陷[1-4],如小剂量的阿片类药物治疗慢性疼痛的效果不佳,用量过大会导致恶心、呕吐、呼吸抑制等副作用,长期应用还可能发生耐受。临床上迫切需要新的更为有效的治疗疼痛的药物。慢性疼痛如神经病理性疼痛是炎症或神经损伤所导致的痛觉神经细胞高反应性的一种表现。外周伤害性刺激或组织损伤引起初级传入神经末梢释放兴奋性的氨基酸(EAAs)和其它一些神经递质到脊髓后角。这些兴奋性氨基酸(EAA)如N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)可以通过其受体而介导脊髓后角及其它部位的突触后兴奋的传递。Yu和Salter等[3]发现NMDA受体上调可以引起细胞内钠离子浓度升高,导致突触间兴奋性传递增强,从而产生痛觉中枢敏感性增高。因此,通过阻断NMDA受体而抑制NMDA的神经兴奋性递质作用,可以阻断痛觉的中枢兴奋性传导,治疗慢性疼痛。但是,目前的NMDA受体阻断剂[5-6]如MK-801和APV都有很强的毒副作用,不能在临床上使用。所以Garry等[4]提出可以利用基因干扰NMDA受体基因来治疗慢性疼痛。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,指内源性或外源性与靶基因的转录产物mnRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在细胞内特异降解该mRNA,从而使特异性的基因有效封闭的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)[7]。要将siRNA成功导入体内,并能够安全且又高效抑制基因的表达,合适有效的转导工具是关键,目前,病毒载体无疑是效率很高的基因转导工具,然而,因为安全的原因,病毒载体适合离体细胞,但不适合以治疗为目的的在体细胞。最近,人们又寻找到了新的导入介质—由低分子量PEI和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water-soluble lipopolymer, WSLP),利用WSLP直接与siRNA连接,形成WSLP/siRNA复合物,将其导入离体和在体细胞,具有高效的转染效率和较小的的细胞毒性,而且没有病毒载体的安全顾虑[8-9]。综上所述,我们推测：使用WSLP运载NR1-siRNA,可以抑制脊髓NMDA受体的表达,最终达到治疗疼痛的目的。本研究以NR1为靶点,先构建NR1-siRNA,再制备新的基因运载体WSLP,将WSLP直接与NR1-siRNA寡核甘酸链连接以合成WSLP/siRNA,建立大鼠鞘内置管模型,运用实时荧光定量PCR技术和western-blot技术检测鞘内注射WSLP/siRNA后正常SD大鼠脊髓NR1表达的变化；然后建立神经病理性痛大鼠模型,检测鞘内注射WSLP/siRNA后神经病理性痛大鼠脊髓NR1表达的变化及观察大鼠行为学的变化,以探讨WSLP/siRNA治疗慢性疼痛的可行性,为疼痛的治疗提供新思路、新方法。目的证实鞘内注射WSLP/siRNA复合物沉默大鼠脊髓NR1表达,观察鞘内注射WSLP/siRNA复合物对神经大鼠病理性痛的治疗作用,为进一步的观察WSLP运载siRNA治疗慢性疼痛的可行性及其优势打下基础。方法研究过程分为四部分进行。(1)合成WSLP/siRNA。①参照文献合成WSLP;②参照文献选取NR1-siRNA序列,由广州锐博公司合成NR1-siRNA;③合成WSLP/siRNA,参照文献以及前期研究结果,将WSLP和siRNA按照质量比为5：1混合后,室温下静置30min。(2)水溶性脂质体运载siRNA沉默大鼠脊髓NR1的可行性的实验研究。取鞘内置管成功的成年SD大鼠18只,随机均分为3组：NS组(鞘内注射生理盐水,n=6)、裸siRNA组(鞘内注射裸siRNA,n=6)、 WSLP/siRNA组(鞘内注射WSLP/siRNA混合物,n=6),鞘内注射容积均为10μl,其中siRNA的量为1nmol,制作鞘内置管模型参照文献进行。鞘内注射第4天冰面上摘取L4-6节段脊髓,均分为两份,存放液氮中。①取各组脊髓标本,提取总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测各组大鼠脊髓中NR1mRNA表达变化。②取各组脊髓标本,采用western-blot的方法,检测各组大鼠脊髓中NR1蛋白表达的变化。(3)水溶性脂质体运载NR1-siRNA对神经病理性痛大鼠脊髓NR1表达的影响。参照文献制作大鼠神经病理性痛模型和鞘内置管模型,将24只SD健康成年大鼠随机分为4组：假手术组(Sh组,n=6)、神经病理性痛组(NS组,鞘内注射生理盐水,n=6)、神经病理性痛治疗组(WSLP组,鞘内注射WSLP/siRNA混合物,n=6)及乱序siRNA治疗神经病理性痛组(sWSLP组,鞘内注射乱序WSLP/scRNA混合物,n=6)。神经病理性痛模型采用坐骨神经分支选择结扎切断模型(Spared nerve Injury model, SNI)。神经病理性痛模型和鞘内置管模型制作后第2天鞘内分别注射鞘内注射生理盐水、WSLP/siRNA混合物、WSLP/scRNA混合物。鞘内注射第4天冰面上摘取L4-6节段脊髓,均分为两份,存放液氮中。①取各组脊髓标本,提取RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测各组大鼠脊髓中NR1mRNA表达变化。②取各组脊髓标本,采用、western-blot的方法,检测各组大鼠脊髓中NR1蛋白表达的变化。(4)水溶性脂质体运载NR1-siRNA对神经病理性痛大鼠痛行为学的影响。参照文献制作大鼠神经病理性痛模型和鞘内置管模型,将24只健康成年SD大鼠随机均分为4组：S组(n=6)、C组(n=6)、W组(n=6)和L组(n=6)。S组只制作鞘内置管模型和暴露坐骨神经；C组、W组和L组分别在神经病理性痛模型和鞘内置管模型制作后第2天鞘内分别注射鞘内注射生理盐水、WSLP/siRNA混合物、WSLP/scRNA混合物。分别于造模前1天、造模后1天、造模后第3天、造模后第5天、造模后第7天观察大鼠行为学变化,采用累积疼痛评分法来评估大鼠的神经病理性疼痛。结果(1)水溶性脂质体运载siRNA沉默大鼠脊髓NR1可行性的实验研究。研究结果如下：①实时荧光定量RT-PCR检测结果NS组、裸siRNA组和WSLP/siRNA组三组大鼠脊髓NR1mRNA表达水平是有统计学差异的(F=1116.629,P<0.01)；其中裸siRNA组与NS组脊髓NR1mRNA表达水平无明显差异(P=0.441),WSLP/siRNA组较NS组脊髓NR1mRNA表达水平下降(P<0.01)。②Western-Blot检测结果NS组、裸siRNA组和WSLP/siRNA组三组大鼠脊髓NR1蛋白表达水平是有统计学差异的(F=155.358,P<0.01)；其中裸siRNA组与NS组比较脊髓NR1蛋白表达水平无明显差异(P=0.149)；而WSLP/siRNA组较NS组脊髓NNR1蛋白表达水平下降(P<0.01)。(2)水溶性脂质体运载NR1-siRNA对神经病理性痛大鼠脊髓NR1表达的影响。研究结果如下：①实时荧光定量RT-PCR检测结果四组脊髓NR1mRNA表达水平是有统计学差异的(F=344.179,P<0.01)。与S组比较,C组脊髓NR1mRNA表达水平显著增强(P<0.01),L组脊髓NR1mRNA表达水平也显著增强(P<0.01)；与C组比较,W组脊髓NR1mRNA表达水平显著降低(P<0.01),L组脊髓NR1mRNA表达水平无明显变化(P=0.201)。②、Mestern-Blot检测结果四组脊髓NR1mRNA表达水平是有统计学差异的(F=741.420,P<0.01)。与S组比较,C组脊髓NR1蛋白表达水平显著增强(P<0.01)；L组脊髓NR1蛋白表达水平也显著增强(P<0.01)；与C组比较,W组脊髓蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而L组脊髓蛋白表达水平无明显变化(P=0.596)。(3)水溶性脂质体运载NR1-siRNA对大鼠神经病理性痛累积疼痛评分的影响。鞘内注射WSLP/NR1-siRNA对神经病理性痛大鼠累积疼痛评分的影响差异有统计学意义(F=458.347,P<0.01)；手术前后时间对累积疼痛评分的影响差异有统计学意义(F=749.112,P<0.01)；手术前后时间与鞘内给药之间有交互效应(F=86.405,P<0.001)。术后3天,四组大鼠累积疼痛评分的差异有统计学意义(F=224.042,P<0.01)；与术后3天C组比较,术后3天W组累积疼痛评分降低(P<0.01),而术后3天L组累积疼痛评分无明显变化(P=0.370)。结论(1) WSLP可有效运载siRNA沉默正常SD大鼠脊髓NR1mRNA和蛋白表达。(2)WSLP可有效运载siRNA抑制神经病理性痛大鼠NR1mRNA和蛋白的过度表达。(3) WSLP可有效运载siRNA治疗大鼠神经病理性痛。