论文部分内容阅读
牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus,BEFV）是引起牛流行热（Bovine ephemeral fever,BEF）的病原体,能够引起病牛高热、呼吸困难、奶牛产奶量下降、生育率下降等临床症状,给养牛业造成巨大损失,严重影响经济效益,农业部已于2014年将牛流行热列为重点防控的牛传染病之一。目前对于该病的防控主要以疫苗免疫为主,但防控效果不理想。因此,深入研究BEFV复制的分子机制,尤其是宿主蛋白与病毒蛋白相互作用调控病毒复制的机制,以期发现新的药物靶点,为抗病毒药物的研发提供新思路。膜联蛋白A2（Annexin A2,AnxA2）是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,参与调节胞吞、胞吐、膜结构域的形成、细胞增殖等,其N端结构域可影响该蛋白在细胞中的定位及功能,C端结构域是AnxA2蛋白与其它蛋白结合并发挥作用的基础。尽管AnxA2调控非洲猪瘟病毒等的复制,但尚未见AnxA2参与BEFV复制的报道。BEFV基质蛋白（M）,是由M基因编码的脂双层内膜蛋白,分布于病毒包膜与核衣壳之间。与BEFV同为弹状病毒科的狂犬病毒、水泡性口炎病毒等病毒的M基因功能报道较多,而BEFV M蛋白的研究鲜有报道。本论文主要围绕AnxA2与病毒M基因在BEFV复制中的关系开展了如下研究:（1）检测了AnxA2在BEFV感染后表达的变化及其在BEFV复制中的作用。0.1 MOI BEFV接种细胞,与不同时间点收集细胞,检测AnxA2 mRNA和蛋白的表达,结果显示,AnxA2的mRNA和蛋白表达均呈上调趋势,尤其是病毒感染48 h时差异显著。构建AnxA2的慢病毒表达载体pLVX-AnxA2-Flag-IRES-Puro,建立稳定过表达AnxA2基因的细胞系;接种0.1 MOI BEFV,检测病毒TCID50,与对照比较,过表达AnxA2促进BEFV的释放。设计并合成靶向抑制AnxA2的siRNA,并转染BHK-21细胞沉默AnxA2基因,检测病毒TCID50,与对照相比,沉默AnxA2抑制BEFV的释放。上述结果表明,AnxA2促进BEFV的释放。（2）检测AnxA2与M蛋白的相互作用并定位结合位点。GST Pull-down和免疫共沉淀实验检测发现,BEFV的基质蛋白M与AnxA2蛋白之间存在相互作用。根据网站软件预测,将AnxA2蛋白划分为两段结构域,发现M蛋白与AnxA2蛋白的第二段结构域（AnxA2-C2,186-340 aa）相互作用。为了进一步定位M蛋白与AnxA2蛋白结合的结构域,将AnxA2划分为五个结构域,经免疫共沉淀实验检测发现,M蛋白与AnxA2蛋白的第五个结构域（AnxA2-V,268-334 aa）结合。（3）探讨AnxA2与M蛋白相互作用促进BEFV复制的分子机制。过表达M基因,检测接种BEFV后的总病毒滴度及细胞培养上清中的病毒滴度,过表达M显著地促进BEFV的释放。通过质膜分离实验检测发现,AnxA2蛋白促进M蛋白在细胞膜上的定位。细胞转染AnxA2缺失突变体AnxA2-△V,接种0.1MOI BEFV,检测病毒滴度,与对照细胞比较,细胞上清中BEFV滴度显著下降。上述结果表明,AnxA2通过其V结构域与M蛋白结合促进M蛋白在细胞膜上的定位,进而促进BEFV病毒粒子的释放。本研究从AnxA2与BEFV复制的关系出发,以AnxA2蛋白与BEFV M蛋白之间相互作用为切入点,率先发现AnxA2基因在BEFV复制过程中的作用,揭示了AnxA2蛋白通过其268-334 aa结构域与M蛋白结合促进BEFV释放的分子机制,为抗病毒药物研发提供了线索。