脑卒中是威胁人类健康的三大疾病之一,具有患病率高、复发率高、致残率高、死亡率高的特点。缺血性卒中占脑卒中的60%～80%,然而临床上尚缺乏有效治疗缺血性脑卒中药物。目前用于临床治疗脑缺血的药物缺乏,得到WHO认可的仅有组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogenactivator,tPA),但是由于其治疗时间窗短,仅有3-6h,以及tPA可能导致颅内出血和脑水肿的风险,致使真正受益于tPA的患者极少,限制了该药的临床运用范围。因此寻找和开发治疗脑缺血的药物是目前医药工作者亟待解决的问题。既往众多针对改善神经元功能为单一靶点的药物研发没有一个在临床证实有效的事实,使医药学家逐渐关注针对脑“神经血管单元”保护与修复治疗脑缺血的新策略。脑“神经血管单元”就是把神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞以及基质细胞,作为脑组织的结构和功能单位来进行研究和药物研发的靶标。地黄是滋阴补血,补肾填精的传统中药,课题组前期研究表明地黄活性成分梓醇具有减轻缺血内皮水肿,参与神经血管重塑的能力,有望成为脑“神经血管单元”保护和重构神经网络的新药。但是梓醇是否对脑“神经血管单元”主要成分如神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞具有确切的保护作用还不清楚,梓醇是否对脑缺血后神经元自噬产生调控也不明晰。故本课题分为三大部分研究梓醇对缺血后脑“神经血管单元”保护及其机制：1.原代培养组成脑“神经血管单元”主要成分如神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞,以脑缺血后病理病生变化损伤级联产物如兴奋性氨基酸谷氨酸、氧化应激损伤因素如双氧水、一氧化氮供体硝普钠分别损伤神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞,观察梓醇改善上述损伤因子对脑“神经血管单元”损伤作用；初步确定梓醇对“神经血管单元”的保护作用。2.从整体上观察梓醇对脑缺血后神经血管单元构筑的影响。3.以“神经血管单元”中神经功能的直接执行者神经元作为研究对象,探索梓醇是否通过自噬或凋亡挽救缺血缺氧损伤的神经元,从自噬的角度探索梓醇改善神经元功能的可能机制。第一部分梓醇对“神经血管单元”各重要组成细胞的原代细胞的保护作用的研究。方法：原代培养“神经血管单元”各重要组成部分的原代细胞以及利用工具药造成不同类型损伤模拟脑缺血病理过程：1、原代培养神经元,并以不同剂量谷氨酸(4mM,8mM,16mM,32mM)损伤模拟脑缺血病理过程,以不同剂量的梓醇(0.3μM,3μM,30μM,300μM)干预治疗2、原代培养星形胶质细胞,并以不同剂量的过氧化氢(62.5μM,125μM,250μM,500μM,1000μM)损伤模拟脑缺血病理过程,以不同剂量的梓醇(10μM,30μM,100μM,300μM)干预治疗3、原代培养脑微血管内皮细胞,并以不同剂量的硝普钠(125μM,250μM,500μM,1000μM,2000μM)诱导损伤细胞模拟脑缺血病理过程,并以不同剂量的梓醇(3.33μM,10μM,30μM)干预。采用MTT分别测定神经元,星形胶质细胞,脑微血管内皮细胞各工具药损伤后的细胞存活率以及梓醇干预后细胞的存活率。最后通过ELISA试剂盒检测硝普钠诱导损伤前后加入不同浓度梓醇对脑微血管内皮细胞分泌BDNF的作用。结果：在4mM到32mM范围内谷氨酸对神经元损伤呈剂量依赖性,在4mM谷氨酸诱导神经元损伤24h后,0.3μM梓醇和3gM梓醇可以促进神经元的存活。在62.5μM到1000μM范围内过氧化氢对星形胶质细胞损伤呈剂量依赖性,以250μM过氧化氢诱导星形胶质细胞的损伤,30μM梓醇,100μM梓醇,300μM梓醇均能促进星形胶质细胞的存活。在500μM到2000μM范围内,硝普钠对脑微血管内皮细胞的损伤呈剂量依赖性,以1000μM的硝普钠诱导脑微血管内皮细胞的损伤,3.3μM梓醇和10μM的梓醇均能显著性促进细胞的存活。在硝普钠诱导脑微血管内皮细胞损伤前,不同浓度的梓醇均能促进脑微血管内皮细胞BDNF的分泌,在硝普钠诱导脑微血管内皮细胞损伤后,梓醇进一步促进BDNF的分泌。结论：梓醇促进“神经血管单元”各重要组成细胞的存活,并且可能通过促进脑微血管内皮细胞分泌BDNF促进脑微血管内皮细胞的存活,基于BDNF的良性作用,梓醇也可能通过内皮分泌BDNF司接参与神经元的保护。第二部分不同剂量梓醇对脑缺血大鼠的保护作用的研究方法：采用线栓法制备大鼠脑缺血2h再灌注24h模型,结合Bederson评分,神经肌肉功能评分,角落实验,脑梗死面积测定(TTC染色),以及“神经血管单元空间构筑”探索不同剂量的梓醇对脑缺血大鼠的保护作用,以免疫荧光技术检测自噬体标志LC3的表达,初步探索梓醇对脑缺血发挥保护作用可能的机制。结果：Bederson评分结果显示梓醇各剂量组相对于模型组并没有显著性差异,但是神经肌肉功能评分和角落实验均显示梓醇高剂量(10mg/kg)相对于模型组有显著性差异。TTC染色检测脑梗死面积结果显示梓醇低剂量组(1mg/kg)和梓醇中剂量组(5mg/kg)作用不显著,仅梓醇高剂量组(10mg/kg)显著性改善脑缺血脑梗死面积,梗死面试相对于模型组(0.267±0.024)减少到0.205±0.026,p<0.05。“神经血管单元”空间构筑结果显示梓醇中剂量(5mg/kg)损伤侧,梓醇高剂量组(10mg/kg)相对模型组均具有一定的改善,血管数目增多,且管腔较饱满；神经元状态相对模型组稍有改善,尼氏体着色较深,梓醇高剂量组神经元数目明显多于模型组神经元数目；星形胶质细胞数目也明显多于模型组数目。免疫荧光结果表明,梓醇组相对于模型组促进了LC3的表达。结论：大鼠脑缺血2h再灌注24h后,梓醇高剂量组(10mg/kg)可以显著改善脑缺血后神经功能,减少脑梗死面积,维持“神经血管单元”结构的完整性。梓醇发挥对脑缺血保护作用的机制可能与自噬有关。第三部分 梓醇通过调节自噬和凋亡途径保护过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的研究方法：体外培养PC12细胞,以不同浓度过氧化氢诱导PC12细胞损伤,以模拟脑缺血时神经元的损伤。观察梓醇对PC12损伤的量效和时效关系,确定梓醇和过氧化氢的浓度。采用MTT测定细胞存活率筛选适当的损伤浓度和作用时间,再以不同浓度的梓醇干预损伤的PC12细胞,测定梓醇干预后细胞的存活率。利用Western Blot技术检测PC12凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax, Cleaved-Caspase3的表达,以及自噬相关蛋白P62,Bclinl,LC3的表达情况。细胞免疫荧光检测LC3的表达。结果：MTT结果显示,24h内不同浓度的过氧化氢均随着作用时间的延长,细胞损伤逐渐增大,250gM过氧化氢在损伤12h后,细胞的存活率为81.78%。不同浓度的梓醇均可以直接促进PC12细胞的存活。以250μM过氧化氢诱导PC12细胞损伤12h后,不同浓度的梓醇均能促进细胞的存活,细胞存活率与梓醇浓度呈剂量依赖性,其中1mM梓醇促进细胞存活率最高。Western Blot结果显示,不同浓度的梓醇加入后,Bax的表达被下调,Bc12的表达被上调,同时抑制cleaved-Caspase3的表达。同时,1mM梓醇可以促进LC3Ⅱ和Beclinl的表达,P62的表达被下调。梓醇组LC3荧光加强,促进了LC3的表达。结论：不同浓度的梓醇均能通过抑制凋亡保护过氧化氢诱导的PC12细胞损伤,机制可能与上调Bcl2/Bax和抑制caspase3的激活有关。同时高浓度的梓醇还可以通过激活自噬促进细胞的存活,其机制可能与下调P62,上调Beclinl有关。