肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)具有多种生物学功能，在体内以跨膜型(TransmembraneTNF-α，TM-TNF-α)和分泌型(secretedTNF-α，S-TNF-α)两种形式发挥作用。TM-TNF-α是S-TNF-α的前体。在一级结构上，TM-TNF-α比S-TNF-α多一个由76个氨基酸组成的信号肽。本室前期研究工作表明，TM-TNF-α比S-TNF-α具有更广的杀瘤谱，可杀伤S-TNF-α耐受的肿瘤细胞；TM-TNF-α主要引起靶细胞凋亡，S-TNF-α则主要引起靶细胞坏死。 TM-TNF-α不但可以作为配体，与受体结合传递正向信号，而且还可作为受体向效应细胞传递反向信号。已发现反向信号对效应细胞本身的功能具有调节作用。由于表达TM-TNF-α的细胞同时表达TNFR，因此，在研究反向信号中难以消除正向信号的干扰。在我们前期研究TM-TNF-α结构与功能关系时，发现在-28位将半胱氨酸置换成苯丙氨酸，使TM-TNF-α的杀伤作用完全消失，但仍然保留与TNFR的结合能力。据此推测该突变体可能失去了正向信号，但却仍然保留反向信号。为此，本研究的主要目的是验证该突变体是否仅能传递反向信号，为研究TM-TNF-α反向信号提供有力的实验工具。该研究主要结果如下： 一、C-28FTM-TNF-α突变体丧失正向信号 1.C-28F位突变体丧失诱导单核细胞系U937细胞产生NO的能力：结果显示未经刺激的U937细胞分泌基础量的NO，转染野生型TM-TNF-α的COS-7可明显诱导U937细胞产生NO，而转染C-28F突变体的COS-7细胞却失去TM-TNF-α诱导U937细胞产生NO的能力。 2.C-28FTM-TNF-α突变体丧失诱导U937细胞产生iNOSmRNA的效应：RT-PCR和realtimePCR证实正常U937细胞表达少量iNOSmRNA，转染野生型TM-TNF-αCOS-7细胞能显著提高U937细胞的iNOSmRNA转录，其表达提高了约90％，而转染C-28F突变体的细胞则无TM-TNF-α的这种效应。 3.C-28FTM-TNF-α突变体丧失杀伤HL-60细胞的能力：AnnexinV和PI检测证实转染野生型TM-TNF-α的COS-7细胞具有明显的杀伤效应，其杀伤率为79％；但转染C-28F突变体的细胞与其它对照一样，对HL-60细胞不具有杀伤效应。提示C-28F突变体失去了TM-TNF-α对耐受sTNF-α肿瘤细胞的杀伤效应。 4.C-28FTM-TNF-α丧失抑制Raji细胞I-κB降解的效应：Westernblotting结果显示转染野生型TM-TNF-α的COS-7细胞能够有效地抑制Raji细胞胞浆内I-κB的降解，而转染C-28FTM-TNF-α突变体的细胞则无此效应，因靶细胞胞浆内I-κB含量与各种对照比较无明显差异。 二、C-28FTM-TNF-α突变体保留野生型TM-TNF-α的反向信号 1.野生型和C-28F突变型TM-TNF-α反向信号促进S-TNF-α诱导IL-8mRNA的转录：RT-RealtimePCR证实S-TNF-α可刺激U937细胞IL-8mRNA转录，用sTNFR1激活内源性TM-TNF-α反向信号，可明显促进S-TNF-α诱导的IL-8mRNA转录；转染野生型和突变型C-28FTM-TNF-α可明显增强该反向信号的效应。提示C-28F突变体仍然保留TM-TNF-α传递反向信号的功能。 2.野生型和C-28F突变型TM-TNF-α反向信号促进I-κB降解：Westernblotting显示转染野生型和C-28F突变型TM-TNF-α均能够传递反向信号，促使I-κB降解(下降20％)；而转染缺失胞浆段TM-TNF-α则无此效应。 结论：C-28FTM-TNF-α突变体丧失TM-TNF-α传递正向信号的能力，但仍保留了反向信号传递功能，从而可作为有效工具用于深入研究TM-TNF-α反向信号。