研究背景众所周知,人体中大部分恶性肿瘤的发生往往是多基因突变的过程,所以,往往随着年龄的增加,肿瘤的发病率会不断增加,这就是关于肿瘤发生的经典的基因突变理论。但是,也有些肿瘤如骨肉瘤、白血病、尤文肉瘤等,其发病的高峰有其特殊的年龄段,这往往与基因突变理论相悖。近年来发现,这些年轻化的肿瘤的发生往往与机体内多种生长因子的自分泌及旁分泌机制有关。骨肉瘤是骨科临床中最常见的原发性恶性肿瘤,其往往发生于青少年的生长发育高峰期,并且好发于代谢最活跃的干骺端,虽然新辅助化疗联合手术治疗使得骨肉瘤患者的生存率得到了很大的提高[2],但是近二十年来,骨肉瘤患者的生存率已进入了一个平台期,所以临床急切需要一个新的治疗方法来提高骨肉瘤患者的生存率。近年来研究发现,很多肿瘤的生长依赖于生长因子及其受体的自分泌及旁分泌机制,骨肉瘤在形成和发展中也往往伴随着多种生长因子的异常表达[3,41,患骨肉瘤的青少年的身高往往高于正常同龄人。在青春期,人体内除了出现性激素的高峰外,生长激素的分泌也十分旺盛,而生长激素对骨骼的发育不起直接作用,而是通过另一类细胞因子间接地起着作用,这类因子被命名为“IGF-1”和“IGF-2”,从而科学界设想是否在骨的恶性肿瘤中胰岛素生长因子(Insulin like Growth Factor,I(讯)也起着一定的作用呢?随着生长因子IGF被发现后,与之相关的因子相继被发现,最终形成了一个生长因子家族——IGF家族。到目前为止,胰岛素生长因子家族(IGF)中被确定的成员包括：两个受体(IGF-1R和IGF-2R),两个配体(IGF-1和IGF-2),六个结合蛋白(IGFBP1-6)和四个相关多肽(IGFRP1-4)。IGF-1是一条由70个氨基酸组成的多肽链,其基因位于第12号染色体。IGF-2由67个氨基酸组成,其基因位于第11号染色体,并且靠近父系印记基因H19区。虽然肝脏是循环中的IGF-1的主要来源,但是事实上人体中大部分器官都能合成IGF,并且IGF对人体中多种细胞发挥着生理作用。其产生和生理活性的广泛性,使得这类生长因子除了一般的内分泌机制外,还存在着自分泌和旁分泌机制[6]。IGF在机体的生长、发育及内环境的稳定中发挥着重要的作用,但是他们的半衰期很短,循环中的六种结合蛋白有效的延长了IGF在机体中的作用,这些结合蛋白结合IGF后,负责转运它们与特定的靶组织结合。结合蛋白也调节着IGF配体与受体结合的生物活性,游离的IGF和结合蛋白之间的平衡决定着细胞的生存及死亡。血清中IGF-1具有年龄相关性,其含量从出生到青春期慢慢地增加直至峰值,此后随着年龄的增长逐渐下降。血清中IGF-2的浓度大约为400-600n/m1,高于IGF-1(100-200n/m1),在青春期后,其含量趋于稳定并且不受生长激素(GH)的调节。尽管IGF-2在循环中存在并且较高浓度,但是其对机体的作用却远小于IGF-1。在机体中,IGF通过与受体结合发挥生理作用,这其中主要包括两类受体IGF-1R和IGF-2R。IGF-1R是四聚体复合物,由胞外两个相同的a-亚基和胞内两个相同的β-亚基构成。胞外亚基能结合配体,胞内亚基有酪氨酸激酶活性。IGF-1R与胰岛素受体(IR)具有60%的同源性,但其主要参与正常细胞的增殖和分化调节,其代谢作用甚微,研究证明先天缺乏IGF-1R的小鼠,出生后存在肺脏、神经、皮肤和骨骼等多器官组织的缺陷。IGF-1R也被发现与肿瘤进展和多种肿瘤细胞的表型转化密切相关,一项研究表明,小鼠胚胎细胞敲除此受体后对多种因素诱导的细胞转化具有耐受性。与其它酪氨酸激酶受体(如EGFR)相同,IGF-1R需要配体结合才能激活下游通路,单纯的IGF-1R过表达不足以导致受体的激活。IGF-2R,也被称为磷酸甘露醇-6(M6R)受体,是一条没有内源性酪氨酸激酶活性的单链受体,其在机体中主要作为IGF-2的沉默受体,只与循环中的IGF-2结合,降低IGF-2和IGF-1R结合的生物活性[10]。IGF-2R的缺失使得更多的IGF-2与IGF-1R结合,从而促进细胞的增殖,在多种肿瘤研究中发现有IGF-2R的缺失,现普遍认为,IGF-2R属于一种肿瘤抑制因子,在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。IGF家族与骨肉瘤关系的研究早在二十年前就有人开展了[12],但由于当时认识的局限及技术的限制,其研究不够深入,也没得出有意义的结论。但近年来,随着IGF-1R靶向治疗在尤文肉瘤治疗显示出了一定的疗效,使得科学家们重新开始了针对IGF家族的研究。迄今为止,关于IGF家族在骨肉瘤的研究也进行了不少,有研究表明对骨肉瘤细胞来说,IGF-1是一类强有力的生长因子,抑制生长激素-IGF-1轴能有效地抑制骨肉瘤的生长。IGF-1和IGF-2是骨骼中含量最丰富的生长因子,特别是IGF-2,在体外能由成骨细胞合成,并且都能促进成骨细胞的增殖和分化[16]。Sofia等研究发现骨肉瘤患者血清中IGF-1和IGFBP-3的含量比正常对照组低,而IGF-2的含量显著上调,并且IGF-2含量越高提示预后越差。当肿瘤切除后,IGF-1和IGF-2含量恢复正常。其后,他们在体外利用si-RNA技术下调培养基中IGF-2的含量,发现能显著抑制骨肉瘤细胞株MG-63的生长。在大多数组织中IGF-2处于先天性的休眠状态,但在肿瘤组织中IGF-2的表达常被激活[18,19]。骨肉瘤细胞和组织中高表达IGF-2的mRNA,表明在骨肉瘤中IGF-2的表达是激活的[121。这些都提示对于骨肉瘤细胞而言,IGF-2比IGF-1可能起着更为重要的作用。Wang等发现在正常骨组织中IGF-1R不表达,而在骨肉瘤组织中存在过表达,并且这种过表达与骨肉瘤患者的肿瘤转移及预后密切相关,下调IGF-IR的表达能抑制骨肉瘤细胞的生长,促进凋亡并且增强骨肉瘤细胞对放化疗的敏感性。体外培养HOS58骨肉瘤细胞株,发现其增殖能力与IGF-IR的表达密切相关,随着IGF-1R表达的下调其增殖能力减弱。骨肉瘤由变异的骨前体细胞衍生而来,也分泌IGF-1,IGF-I/IGF-IR自分泌循环通路与骨肉瘤的生长密切相关[22],但是,在骨肉瘤中,针对IGF-1R的小分子激酶抑制剂的临床效果却显得十分有限[23]。虽然IGF家族在骨肉瘤中所起作用的研究很多,但是结果并不完全一致。本研究拟系统性研究IGF家族在骨肉瘤发生发展中的作用,我们通过检测骨肉瘤病理标本中IGF家族各成员的表达,来分析这些因子表达与骨肉瘤患者预后及临床病理特点的关系。并且,我们通过常见骨肉瘤细胞株的体外实验来验证IGF-1R的表达,进一步明确IGF家族在骨肉瘤发生发展中的作用,不仅有利于深入认识骨肉瘤的发生机制,而且将为骨肉瘤的治疗提供新的理论基础和新思路。研究目的1.明确在骨肉瘤生长中发挥主要作用的IGF配体；2.研究IGF家族成员表达与骨肉瘤患者肿瘤类型、分期及预后的关系；3.检测常见骨肉瘤细胞株表面IGF家族成员的表达；4.研究并验证IGF家族成员对骨肉瘤的作用。研究方法1.免疫组化方法检测骨肉瘤组织中IGF-1、IGF-2、IGF-1R及IGF-2R的表达；2.统计分析骨肉瘤组织中IGF-1、IGF-2、IGF-1R及IGF-2R的表达与患者临床病理学因素及预后的关系；3.培养常见骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2,研究在这两种细胞株表面IGF受体的表达；4.应用IGF-1R受体抑制剂aIR-3共培养骨肉瘤细胞,研究其对骨肉瘤细胞株生长增殖的影响,为骨肉瘤的靶向治疗提供一定的理论依据。研究结果1.IGF家族在骨肉瘤微环境中的作用运用免疫组织化学方法检测IGF家族四个成员IGF-1、IGF-2、IGF-1R及IGF-2R在骨肉瘤病理切片中的表达。结果发现在49例骨肉瘤病理组织中,上述分子均有阳性表达,并且主要表达于细胞浆中,在核膜及核内表达较少,但是,如果综合考虑免疫表达的强度和面积,其中26例患者的IGF-1呈现强阳性而只有2例患者的IGF-2呈现强阳性,这提示在骨肉瘤组织局部,IGF-1的作用比IGF-2更显著。2.IGF-1R的表达水平与骨肉瘤的病理类型相关性通过收集骨肉瘤患者的临床资料,应用统计学方法分析IGF-1R表达与患者的性别、年龄、解剖部位、病理类型及外科分期等临床病理学因素关系。分析表明,IGF-1R的表达水平与骨肉瘤患者的病理类型密切相关(P=0.012),而与其它因素的关系没有统计学意义。恶性程度高的骨肉瘤组织中IGF-1R的表达水平往往高于恶性程度低的骨肉瘤组织。3.IGF-1R的表达水平与骨肉瘤患者的预后的相关性通过电话及信件随访骨肉瘤患者的术后情况,统计出这些患者的生存时间,并且根据IGF-1R的表达情况,将所有患者分成高表达组和低表达组,通过生存分析方法比较两组患者的生存情况,统计发现,低表达组患者的总体生存率显著高于高表达组患者的生存率(P=0.032),说明IGF-1R的表达水平与骨肉瘤患者的预后密切相关。4.MG-63骨肉瘤细胞株表面IGF-1R的表达情况体外培养常见骨肉瘤细胞株MG-63和Saos-2,运用免疫组化方法检查两种细胞株表面IGF-1R和IGF-2R的表达情况,研究结果表明,两种细胞株均表达IGF-1R,但主要于细胞浆内表达,其中以在MG-63细胞株中的表达更为显著。IGF-2R在两种细胞中均呈现阴性表达。5.IGF-1R受体抑制剂能抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖应用常见的IGF-1R受体抑制剂——a-IR3及CCK-8试剂盒,研究a-IR3对骨肉瘤细胞增殖的影响。研究结果表明,低浓度的a-IR3对骨肉瘤细胞的增殖无明显影响,但当浓度达到一定量时,能显著抑制骨肉瘤的增殖。结论1.本研究应用免疫组化方法系统检测了骨肉瘤组织中IGF家族各成员的表达,证实了在骨肉瘤组织局部中确实存在IGF的自分泌和旁分泌机制； IGF家族各个成员均在不同类型的骨肉瘤组织中阳性表达；正常骨组织中IGF-2的含量应远远高于IGF-1,但在骨肉瘤中IGF-1的表达更明显,说明在骨肉瘤发病中,IGF-1是IGF信号通路中主要的配体。这与既往的研究结果相比有所创新。2.本研究发现IGF-1R的表达与肿瘤的恶性程度密切相关,而与患者的性别、年龄、发病部位和外科分期等其它临床指标关系不显著, IGF-1R的表达还与骨肉瘤患者的预后密切相关,IGF-1R的高表达往往提示着预后较差。3.本研究结果表明,骨肉瘤细胞株MG-63和Saos-2两种细胞株均明显表达IGF-1R,而不表达IGF-2R。验证了既往的研究结论。4.通过骨肉瘤细胞株MG-63的CCK-8体外增殖研究发现四个不同浓度梯度的aIR-3与骨肉瘤细胞共培养,只有在浓度达到2.0ug/ml时,IGF-1R受体抑制剂aIR-3才能明显抑制骨肉瘤的增殖。该研究为骨肉瘤的IGF-1R的靶向治疗提供了可靠的理论依据。