背景血液透析(HD)为临床上终末期肾病(ESRD)患者的主要治疗手段,该方法的关键是建立与维持足够的血液循环通路。在HD过程中,持续的血管通路是保障患者能得到及时救治的重要环节。目前约有超过70%的ESRD患者通过HD进行肾替代治疗。采用穿刺榜动脉-头静脉的自体动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)的方法进行透析。相较于其他透析通路,AVF能够有效降低并发症和感染的风险,且治疗的费用相对低廉、穿刺和压迫操作简单易行,再干预率更低,所以越来越为广大HD患者接受和采用。良好和成熟的AVF为HD患者的生命线,但迄今为止依然缺乏能够有效维持血透通路通畅的方法。AVF功能丧失的主要原因是接近吻合口附近发生严重的静脉内膜增生,从而引起血管狭窄。内膜增生的发生和发展与血管平滑肌细胞(SMC)的过度增殖和迁移有关,同时还受到细胞外基质合成的影响。血管平滑肌在维持血管的稳定方面扮演着重要角色。当血管在外力的作用下受到损伤时,血管中膜SMC受到刺激而大量增生,同时外膜体积增加,最终使血管重塑。此外,血管损伤后通透性上升,引起中性粒细胞与单核细胞外渗,进而刺激炎症因子释放、血管EC黏附因子的表达水平上调,最终促使平滑肌细胞大量增殖和新生EC肥厚。瘘管狭窄的发生机制是血液动力学压力所引起的,属于一个慢性发展过程,由于动脉与静脉或移植血管静脉端与静脉吻合处的血流动力学应力长期增高,再加上术后所造成的内膜损伤和炎症反应等,促使多种炎症因子产生和释放,进而导致内皮细胞(EC)损伤,SMC大量增殖和迁移,大量细胞外基质迁移和沉积,最终造成血管壁增厚,管腔缩小,致使血栓形成,血管闭塞。α-SMA呈阳性表达的血管平滑肌大量增殖引起的血管内膜增生是血管内膜狭窄的主要病理表现。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)为一种碱性多肽,bFGF具有促进血管生成,抑制细胞凋亡和诱导细胞迁移等生物学功能,因此广泛参与许多生理和病理过程,包括器官发育,组织再生和损伤修复。bFGF对血管EC以及血管平滑肌细胞均具有极强的促有丝分裂作用。在血管SMC发生损伤之后可产生和释放出内源性bFGF,经由细胞内分泌以及旁分泌的形式实现对其自身增殖的调控。目前的研究已经证实,bFGF可通过调节血管平滑肌细胞的增殖和迁移参与组织增生和纤维化。还有研究表明,细胞迁移速度随着bFGF浓度的升高而增加,提示血管SMC迁移率与bFGF浓度呈正相关。这种bFGF诱导的迁移效应与血管平滑肌细胞表面成纤维细胞生长因子受体表达有关,同时还与其下游迁移蛋白的表达之间存在密切联系。当EC发生损伤或炎症反应时,局部EC被活化,进而产生和释放出大量的bFGF,经由趋化作用致使单核细胞、中性粒细胞移动至损伤部位,引起炎症反应,bFGF同时还能趋化包括成纤维细胞、EC等在内的细胞参与血管局部损伤的修复和重建。然而,bFGF是否对HD患者的AVF狭窄产生影响仍然是未知的。研究发现,bFGF通常通过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)/Smad3信号传导途径发挥其生物学作用。TGF-β为一种多肽类细胞因子,广泛参与多种生物学功能,包括细胞生长、分化、迁移、细胞外基质分泌和免疫调节。TGF-β1能够通过增加成纤维细胞的趋化性,从而促使胞外基质成分大量产生、促进血管细胞异常增生。在动脉损伤中,TGF-β1大量分泌以抑制基质金属蛋白酶(MMP)的表达并提高蛋白酶抑制剂的表达,促进胶原蛋白的分泌并最终导致血管内膜增生。研究发现,通过腹腔内注射的方法上调机体中TGF-β1基因或蛋白质的表达,能够可以刺激血管SMC的增殖并引起血管内膜增生;而当TGF-β1抗体注射入机体中则可阻断TGF-β1信号通路,进而减少血管内膜增生和推迟血管重塑。TGF-β1主要的信号传导机制与Smad3家族之间存在密切联系。TGF-β1/Smad3信号转导通路与机体中多种生物学过程密切相关,其中包括细胞增殖、免疫抑制、炎症反应等,目前研究得最多的为TGF-β1/Smad3信号转导通路在多种疾病纤维化重构中的作用,此外还与心室重构治疗有关。但目前尚未有关于TGF-β1/Smad3信号通路与AVF狭窄关系的研究。目的本研究检测动静脉内瘘血管中α-SMA的表达,探讨HD患者AVF中bFGF和TGF-β1/Smad3信号通路的关系。同时建立bFGF基因敲除小鼠的颈AVF动物模型,进一步验证bFGF在AVF血管狭窄中的作用机制,为临床AVF的静脉内膜增生、狭窄以致功能丧失的预防和治疗提供一个新思路,旨在提高终末期肾病患者的内瘘通畅率和生活质量,延长其生存时间。方法(1)选择本科室收治的24例5期慢性肾病患者作为研究对象,入选患者均为AVF伴有重度狭窄或闭塞而无法维持正常HD,需要再次入院接受动静脉造瘘,将上述患者列为AVFS组。收集患者的一般信息,包括血管的最小内径、年龄、性别、血清白蛋白(ALB)、血红蛋白(Hb)和胆固醇(CHO)。采集上述所有患者在重建期间内发生AVF狭窄的血管段。另外选择8例因外周血管疾病入血管外科接受血管切除的患者作为对照组。采集各组患者AVF狭窄段静脉血管样品,采用荧光定量PCR检测血管样品中α-SMA和bFGF mRNA的表达,采用westemblot法检测TGF-β1和Smad3蛋白的表达。(2)将C57BL/6小鼠和C57BL/6背景的bFGF基因敲除小鼠随机分为3组,每组10只:control组:将C57BL/6小鼠常规饲养,不进行任何处理;AVF组:C57BL/6小鼠建立颈动脉-颈外静脉的AVF模型,随后进行常规饲养;AVF+sibFGF组:C57BL/6背景的bFGF基因敲除小鼠鼠建立颈动脉-颈外静脉的AVF模型,随后进行常规饲养。上述各组小鼠在进行相应处理后第4周处死,采集颈外静脉样品进行下一步实验研究。在AVF术后采集静脉侧标本,通过HE染色研究静脉内膜的组织学改变。通过荧光定量PCR及Western blot法检测AVF狭窄段血管内膜中TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达。分离培养小鼠下腔静脉血管SMC,随机分为2组,每组设置3个重复:control组:将对照质粒转染C57BL/6小鼠血管SMC;bFGF组:将bFGF过表达质粒转染C57BL/6小鼠血管SMC,检测细胞的增殖活性和迁移能力。结果(1)与对照组相比,AVFS组血管组织中α-SMA和bFGF mRNA的表达水平显着升高(P<0.001),表明AVFS的血管段中存在大量SMC增殖。与对照组相比,AVFS组患者血管中TGF-β1蛋白(P=0.003)和Smad3蛋白(P=0.001)的表达显著增加,表明AVFS的血管段中存在大量SMC增殖,TGF-β1/-Smad3信号通路的激活可能参与了bFGF促进SMC增殖的过程。与对照组相比,AVFS组患者血管中TGF-β1蛋白(P=0.003)和Smad3蛋白(P=0.001)的表达显著增加,表明TGF-β1/Smad3信号通路的激活可能参与了bFGF促进SMC增殖的过程。(2)HE染色结果显示,Control组小鼠静脉结构大致正常,血管内膜为单层EC,外观呈扁平状,排列紧密整齐、边缘平坦,细胞长轴与管腔平行;内皮下无内弹力膜;中膜内为纵行平滑肌和环形平滑肌,其间含有2-3层弹力膜;外膜为由胶原纤维组成的疏松的结缔组织。内膜增生在AVF组的静脉管腔中最突出。局部内膜呈乳头状增生并向对侧管壁延伸。结构紊乱,可见炎性细胞浸润,局部可见增生内膜坏死;SMC增多,胶原纤维增生并与肌层相互混杂;弹力膜受到明显破坏,可见少量FB。在AVF+sibFGF组中,小鼠的静脉壁明显增生,EC排列紊乱,内膜增厚,并且还观察到平滑肌增生。局部EC脱落,ECM增生,中膜外可观察到散在的炎性细胞浸润。但与AVF组相比,bFGF基因敲除后小鼠AVF的狭窄程度较非敲除小鼠得到明显缓解。荧光定量PCR检测结果显示,与control组相比,AVF组和AVF+sibFGF组小鼠静脉样品中TGF-β 1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平均明显增高(P<0.05);与AVF组相比,AVF+sibFGF组小鼠静脉样品中TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。细胞增殖实验结果显示,与control组相比,bFGF组细胞在第3天和第5天的增殖活性明显增高(P<0.05),表明bFGF对血管SMC的增殖具有促进作用。细胞迁移实验结果显示,与control组相比,bFGF组迁移细胞数明显增多(P<0.05),表明bFGF对血管SMC的迁移具有促进作用。结论(1)AVF狭窄血管中平滑肌细胞大量增殖;(2)bFGF通过调控TGF-β1/Smad3信号通路促进血管平滑肌增殖和迁移,进而引起AVF后血管内膜狭窄。