蔗糖转化酶在高等植物中不可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖,是植物糖代谢的关键酶。番茄(Solanum lycopersicum Mill.)是世界上种植面积最广的蔬菜之一,也是研究果实发育和成熟过程的经典模式植物。番茄喜温,但不耐高温。近年来高温胁迫逐渐成为夏季番茄生产中重要的限制因子之一。研究表明高温胁迫下番茄产生落花、子房和幼果败育现象,可能是由光合同化产物向花芽和幼果的运输受到阻碍或者库器官的蔗糖利用能力下降这两方面原因造成。在同化物运输和利用中起关键作用的是蔗糖代谢,尤其是蔗糖转化为己糖(葡萄糖和果糖)的过程。因此蔗糖转化酶有可能是调控番茄果实耐热性的重要因素之一。本课题组前期研究发现,细胞壁蔗糖转化酶(CWIN)和液泡蔗糖转化酶(VIN)在番茄果实的耐热性中发挥了重要作用。其中编码CWIN的Lin7基因是与番茄幼果耐热性相关的重要基因。此外由相关实验推测可能存在未知的番茄液泡蔗糖转化酶(VIN)新基因,并可能也参与了番茄果实耐热性的调控。基于此,本文的研究内容和结果如下：1.Lin9基因的克隆及其高温胁迫下在幼果中的表达分析在NCBI数据库中搜索到一个可能的番茄蔗糖转化酶基因Lin9。利用PCR技术克隆得到Lin9的cDNA序列和基因组序列,该基因序列全长4012bp,由七个外显子和六个内含子构成,开放阅读框长1959bp,编码652个氨基酸。推导的Lin9蛋白属于稳定的亲水性蛋白。Lin9蛋白含有蔗糖转化酶的特征结构域,序列分析显示Lin9属于液泡蔗糖转化酶基因。实时荧光定量PCR结果表明Lin9在花器官中的表达量最高,其余各组织的表达量都处于极低的水平。与已知的番茄液泡蔗糖转化酶基因TIV1相比,Lin9整体处于低表达的水平。推测Lin9可能主要在花器官发育中发挥作用。选用一对耐热(heat-tolerant,略作HT)和热敏感(heat-sensitive,略作HS)番茄材料,运用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术分析番茄幼果经高温胁迫处理后Lin9的表达情况,发现两份材料中Lin9表达量均增加,证明Lin9参与了番茄幼果对高温胁迫的应答。同时HT幼果中的上调量显著高于HS,推测Lin9可能在番茄幼果的耐热性中发挥重要作用。2.Lin7基因的克隆、启动子异源表达分析及转基因番茄植株的获得设计特异引物PCR扩增得到耐热番茄Lin7基因启动子片段、HT和HS的Lin7基因CDS片段。克隆测序结果表明,HT与HS的Lin7基因编码序列(CDS)长1752bp,编码一个长583个氨基酸残基的蛋白。序列比对显示,与HS相比,HT的Lin7基因编码区发生了2个单碱基的突变,其中1个由G突变为A,导致其编码的第553位氨基酸由谷氨酰胺Glu(E)突变为赖氨酸Lys(K)。HT与HS的Lin7-CDS序列存在差异,可能导致两者的基因功能也存在相应的差异。首先将克隆的HT-Lin7启动子片段与报告基因GUS融合,构建植物表达载体并转化拟南芥。GUS染色结果表明,该启动子片段在拟南芥的花药和柱头中有较高的表达活性。接着以pB1121为原始表达载体,分别用HT番茄Lin7基因的内源启动子和HT番茄Lin7基因替换pBI121原有的CaMV35S启动子和GUS基因,得到HT番茄Lin7基因内源启动子驱动Lin7基因表达的重组载体pBI-HT-Lin7,以HS番茄为植物材料转基因。在参考前人实验方法的基础上,通过对HS番茄子叶进行离体培养的适宜条件进行摸索,初步建立了较为理想的番茄再生及遗传转化体系。本实验利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将含有目的基因HT-Lin7的表达载体pBI-HT-Lin7导入HS番茄基因组DNA中,最后获得了11株To转化植株。经NPTⅡ基因的PCR检测,其中的10株是转基因阳性植株。目前得到的10株T0转基因番茄正在温室正常生长,部分已收到T1代种子。综合以上两方面工作,本研究一方面首次克隆了Lin9新基因,表达分析实验暗示了Lin9与番茄幼果耐热性的调控密切相关。另一方面,本研究还将HT番茄Lin7基因导入HS番茄进行Lin7过表达的转基因功能互补验证,已得到T0转基因番茄,部分已收种,这为下一步“Lin7基因提高番茄幼果耐热性”直接证据的获得奠定了坚实的基础。以上研究的最终目的都是为了阐明高温胁迫下蔗糖转化酶调控番茄幼果耐热性的分子机理。