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目的将兔膝骨软骨组织采用Tsmu-A培养液和Tsmu-B培养液保存35天,根据软骨细胞存活率和组织学结果等指标在体外初步比较两种培养液的保存效果,然后将保存后的骨软骨组织移植到兔膝骨软骨缺损处,术后6个月内,根据术膝关节功能、影像学,移植物软骨细胞存活率、组织学、生物力学和免疫学等结果,最终筛选出一种较好的骨软骨组织培养液。方法1.体外实验以新西兰大白兔膝关节骨软骨组织为研究标本,在无菌条件下,从内外侧股骨髁关节面负重区用ARTHREX骨软骨移植器械获取直径约6mm,骨及所带软骨下骨全长约5mm的骨软骨柱120枚,随机均分为4组。分别为Fresh组:新鲜;Tsmu-A组:Tsmu-A液4℃隔日换液培养;Tsmu-B组:Tsmu-B液4℃隔日换液培养;Basic组:基础培养液4℃隔日换液培养,除新鲜组外,余组保存35天后进行检测,检测项目包括FDA-EB双荧光染色、H&E染色、番红O-快绿染色、甲苯胺蓝染色、阿尔新蓝染色、2型胶原免疫组化染色以及含水率;通过分析和比较各组软骨细胞存活率,Makin评分,蛋白多糖、酸性黏多糖、2型胶原含量以及含水率,初步比较两种培养液的保存效果。2.体内动物实验通过动物体内植入实验最终筛选出较佳的培养液。根据上述取材和方法,取24枚兔膝骨软骨组织随机分配为3组,每组8枚,分别为Tsmu-A组:Tsmu-A液4℃隔日换液培养35天,Tmsu-B组:Tsmu-B液4℃隔日换液培养35天,Fresh组:新鲜。在兔左膝股骨滑车软骨面造成5mm x 5mm大小的单个骨软骨缺损,之后将各组6mm x 5mm大小骨软骨组织采用镶嵌移植技术填充到缺损处,另设阴性对照组(Negative组)和假手术组(Sham组),共计5组40只兔膝。术前检测各组兔膝关节活动度(ROM);术后2周时,对术膝行X线和MRI检测;术后6个月,观察动物一般状态,检测术膝X线、MRI和ROM,将动物处死后,对术膝关节进行大体观察,取出骨软骨移植物后再进行如下检测:FDA-EB双荧光法测细胞存活率、H&E染色、番红O-快绿染色、甲苯胺蓝染色、阿尔新蓝染色、2型胶原免疫组化染色、含水率检测、应力-应变测试以及血清免疫学检测,通过观察和比较各组动物间的ROM、影像学指标、软骨细胞存活率、Makin评分、组织活性、应力-应变关系以及IL-6水平,最终筛选出较佳的骨软骨组织体外保存液体。结果1.体外实验(1)细胞存活率变化:在保存35天时,各保存组与新鲜组比较,细胞存活率均明显降低,各组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-B组细胞存活率超过70%,而Tsmu-A组尚不及60%。(2)组织学变化:在保存35天时,各保存组Makin评分均高于新鲜组,蛋白多糖含量均较新鲜组少,各组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-B组比其他保存组Makin评分值和蛋白多糖减少量要小,保存效果最好。各保存组酸性黏多糖和二型胶原含量均较新鲜组少,Tsmu-B组和Tsmu-A组酸型黏多糖和二型胶原含量之间均有统计学意义(P<0.05),且Tsmu-B组高于Tsmu-A组。(3)含水率变化:在保存35天时,各保存组含水率均高于新鲜组,各组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-B组含水率增加最少,Tsmu-A组比Tsmu-B组增加明显。因此,说明Tsmu-B组液体体外保存效果较好。2.体内动物实验(1)一般状态和关节活动度变化:术后6个月,各移植组动物关节形态和功能均发生了不同程度的变化;Tsmu-A、Tsmu-B组关节活动度均小于新鲜移植组和阳性对照组,且Tsmu-A和Tsmu-B组之间比较均有统计学差异(P<0.05)。(2)影像学变化:2周时骨软骨移植物位于移植缺损处,无脱落,关节复位良好,说明移植手术无问题;6个月时,各移植组软骨下骨均有愈合倾向,移植软骨与宿主软骨之间存在不同程度的间隙,信号强度存在差异;Tsmu-B组修复效果较好。(3)大体观察结果:术后6个月,Tsmu-A、Tsmu-B组大体评分均较新鲜对照组小,且组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-B组评分值较小,Tsmu-A组评分较高,说明Tsmu-B组大体观察效果最好。(4)细胞存活率变化:术后6个月,各移植组细胞存活率均低于移植前,且低于术后新鲜组,术后各组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-A、Tsmu-B组细胞存活率分别为17.22±2.56%、49.34±3.29%,均低于70%;但Tsmu-B组存活率相对较高。(5)组织学变化:术后6个月,各移植组软骨与宿主软骨之间均存在不同程度裂隙,Tsmu-B、Fresh组裂隙不明显,Tsmu-A组较明显。Tsmu-A、Tsmu-B两组之间Makin评分具有统计学意义(P<0.05),且Tsmu-B组评分值较低。Tsmu-A、Tsmu-B两组中蛋白多糖、酸性黏多糖及二型胶原含量均较移植前和新鲜组少,两组间各成分比较均有统计学意义(P<0.05)且Tsmu-B组含量较高。(6)生物力学变化:术后6个月,Tsmu-A、Tsmu-B两组杨氏模量和含水率均小于新鲜组,且两组间比较均有统计学意义(P<0.05);Tsmu-B组杨氏模量和含水率值更接近新鲜移植,其移植效果更好。(7)免疫学检测:术后6个月,Tsmu-A和Tsmu-B两组之间IL-6水平均小于新鲜组,且两组之间比较无统计学差异(P>0.05)。结论1.使用Tsmu-B培养液能够更好地保存骨软骨组织,获得更好的移植效果。2.组织液体培养保存骨软骨组织可能会降低移植后的排斥反应。意义本课题通过动物体内外实验,探究两种不同培养液对骨软骨组织的保存效果,依据多种评估标准进行科学比较,最终筛选出一种较佳的骨软骨组织体外培养液,延长了异体骨软骨组织体外保存时间,为我国骨软骨组织库的建立和发展奠定了基础。