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肺炎支原体(Mycoplasma pueumoniae Mp)是儿童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物。其常见的临床表现为呼吸道症状,如发烧发热,气喘等,还可能引起多种肺外并发症,如脑炎,皮肤伤害及消化道受累等症状,若不及时治疗,严重者可危及生命。实时有效的快速检测将是对肺炎支原体预防和控制的一种重要手段。核酸检测是一种检测传染病病原有效准确的方法,常用的核酸检测方法是以PCR为平台进行检测,但是基于PCR的变温核酸扩增检测技术在检测过程中离不开昂贵的检测仪器,不利于在基层检测站及偏远地区中推广应用。而恒温扩增技术摆脱对仪器设备的依赖,在对各种病原的检测中具有很好的发展前景。其中环介导等温扩增法是一种高效、灵敏的核酸扩增方法,该方法简便易行,耗时少,而且不需要精密复杂的仪器和设备,只需要水浴锅就可以完成全程的反应。在本研究中,我们以肺炎支原体保守P1基因为靶标,设计相应引物,建立了肺炎支原体的环介导等温扩增(LAMP)检测方法;通过构建一种茎-环结构的新型引物,建立了一种发夹引物介导恒温扩增检测技术(hairpin-primer-mediated isothermal amplification,HPIA),实现肺炎支原体的快捷灵敏检测;在HPIA基础上引入加速引物,加速了 HPIA检测技术的反应进程;对环介导内引物进行改进,实现环介导等温扩增进行定量检测的初步探索。主要研究内容及结果如下:1、传统LAMP法检测肺炎支原体。以肺炎支原体P1基因为靶序列,设计2条内引物,两条外引物,在65℃进行扩增反应,通过凝胶成像系统观察电泳后的反应结果,同时利用荧光染料钙黄绿素(Calcein 50uM,MnCll20.5mM)、SYBR Green实现可视化检测肺炎支原体。2、HPIA检测肺炎支原体。构建一种茎-环结构的新型引物,建立了一种发夹引物介导恒温扩增检测技术(hairpin-primer-mediated isothermal amplification,HPIA),只需要一对引物,实现肺炎支原体的快捷灵敏检测。以肺炎支原体P1基因为靶序列,设计一对PCR引物,在其5’添加发夹茎环构成茎环结构新型引物,构建发夹引物介导恒温扩增检测技术。该方法最低检测限能达到100zmol,与传统LAMP方法灵敏度相当,并且具有很好的特异性。此外,我们以肺炎支原体P1基因为靶序列设计一对加速引物,加速引物延伸方向与茎环引物延伸方向相反,加速HPIA检测的反应进程。结果显示,添加加速引物扩增反应时间显著缩短,同时表现出强的特异性。3、改良传统环介导内引物,实现对环介导等温扩增定量检测的初步探索。通过引入环介导双哑铃结构的3’端不互补碱基,阻断双哑铃结构的自我聚合反应,实现对环介导扩增的定量检测。我们通过在内引物5’端添加碱基或引入突变碱基来进行实验设计。电泳实验结果显示,条带有一定程度的聚集,但是梯形条带依然明显,这说明环介导定量化研究还需要进一步深入研究。