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目的:本研究旨在通过利用外源性PTHrP作用于C57 BL/6小鼠生长板或生长板软骨细胞,验证PTHrP可通过旁分泌途径调节生长板软骨细胞中HDAC4的核内外穿梭进而调控软骨细胞增殖。方法:1.C57BL/6小鼠胫骨生长板软骨细胞的培养与鉴定。显微镜下对出生3-5天C57小鼠胫骨生长板进行观察并定位,通过HE染色、番红O染色观察生长板组织中软骨细胞的大致形态与分布特点;超净工作台分离生长板组织,采用胰酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化法对小鼠生长板组织进行消化,提取生长板软骨细胞;通过HE染色与番红O染色对细胞大致形态观察,免疫组化实验对所培养软骨细胞Col-Ⅱ进行检测。2.PTHrP对生长板软骨细胞增殖影响的实验研究。将生长板软骨细胞体外培养至第二代后随机分为3个组别:高表达组,培养液中添加外源性PTHrP、Lipo2000;抑制表达组,使用Lipo2000运载PTHLH-homo-617质粒转染软骨细胞;空白对照组,培养液中添加Lipo2000。通过Rt-PCR实验检测软骨细胞增殖相关指标如Sox-9、Col-Ⅱ、Agg、Ihh、Col-Ⅹ、Runx-2及MMP-13的基因表达水平变化;EdU标记实验、CCK-8实验检测软骨细胞增殖情况。3.PTHrP促进生长板软骨细胞增殖相关机制的实验研究。将生长板软骨细胞体外培养至第二代后随机分为2个组别:实验组给予添加外源性PTHrP的培养液,对照组仅给予培养液。通过免疫荧光实验及Western blot实验观察并比较实验组与对照组生长板软骨细胞中HDAC4在胞浆和胞核中的含量及分布;使用PTHrP孵育小鼠生长板组织与细胞,通过免疫组化实验观察并对比两组Runx-2表达水平的差异。结果:1.镜下成功观察到呈半透明状的C57BL/6小鼠胫骨生长板,HE染色与番红O染色可见呈柱状排列的生长板增殖区软骨细胞;成功分离小鼠胫骨生长板并进行细胞培养。2.Rt-PCR结果显示:PTHrP高表达组小鼠生长板软骨细胞中Col-Ⅱ的表达量相较于空白对照组更高,Sox9、Ihh、MMP-13和Runx-2的表达则相对降低(P<0.05);抑制表达组生长板软骨细胞中Ihh的表达量相较于空白对照组增多(P>0.05),Sox-9、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ、Agg、Runx-2及MMP-13的表达水平与空白对照组相比无明显变化(P>0.05)。EdU标记实验结果显示:PTHrP高表达组生长板软骨细胞阳性率高于空白对照组(P<0.05),抑制表达组细胞阳性率与空白组无明显差异(P>0.05);CCK-8实验结果与EdU标记实验结果一致。3.Western blot实验结果显示:空白对照组软骨细胞HDCA4在胞浆与胞核中的表达量相差不大,PTHrP高表达组小鼠生长板软骨细胞胞核内HDAC4的蛋白水平明显高于胞浆(P<0.05);细胞免疫荧光实验结果显示:空白对照组生长板软骨细胞HDCA4荧光围绕胞核分布,且胞浆和胞核中有,而PTHrP高表达组HDCA4荧光主要位于软骨细胞核内,胞浆中几乎没有荧光分布;免疫组化实验结果显示:PTHrP高表达组的小鼠生长板及生长板软骨细胞中Runx-2的蛋白表达水平均低于空白对照组。结论:1.PTHrP可促进小鼠生长板软骨细胞的增殖,且主要通过旁分泌途径发挥作用。2.PTHrP可促进HDAC4由胞浆穿梭入胞核,进而抑制Runx-2的表达发挥其促进软骨细胞增殖的作用。