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背景与目的: 卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一被国际公认并广泛使用的结核病预防疫苗。现已明确其可有效预防儿童重症结核病，但对成人结核病预防效果差。然而，成人是结核病发病的主要人群。因此，在继承卡介苗有效预防儿童结核病的基础上，发展重组卡介苗以增强其预防成人结核病的能力，具有重要的科学意义和实践价值。基于成人结核病的发病机制以及卡介苗不能预防成人结核病的潜在机制，本研究中，我们构建了一种新型的共表达Ag85B（原发感染阶段结核分枝杆菌的分泌抗原）和HspX（潜伏感染阶段结核分枝杆菌特征性表达抗原）抗原的重组卡介苗菌株，即rBCG::XB。免疫C57BL/6小鼠，比较rBCG::XB与rBCG::85B（表达Ag85B蛋白）、rBCG::X（表达HspX蛋白）和BCG抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染的保护效果及其免疫原性，为获得更为有效的卡介苗用于结核病的预防奠定基础。 方法: 1.重组卡介苗 rBCG::XB菌株的构建：构建质粒pMXAg85B并将其电转入BCG中国株而获得重组卡介苗rBCG::XB，然后用逆转录荧光定量PCR（reverse transcription fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）方法检测重组卡介苗中Ag85B和HspX的mRNA表达水平。 2.评价重组卡介苗rBCG::XB抗M.tb感染保护性：将rBCG::XB与rBCG::85B、rBCG::X和 BCG分别免疫C57BL/6小鼠（1×106CFU/只），以PBS为阴性对照，BCG为阳性对照。免疫后第12周，用结核分枝杆菌H37Rv标准毒株经滴鼻方式感染小鼠，感染剂量为1×105CFU/只。分别在感染4、10和20周后（即三个时间点）处死小鼠，对小鼠的肺脏和脾脏进行菌落计数并评估其肺脏病理改变。 3.分析重组卡介苗rBCG::XB的免疫原性：C57BL/6小鼠免疫12和32周后收集小鼠血清或脾细胞。 （1）ELISA方法检测免疫小鼠脾细胞分泌抗原特异的Th1和Th2型细胞因子的水平。 （2）ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗原Ag85B和HspX特异的IgG及其亚类IgG1、IgG2a的水平。 （3）流式细胞术结合胞内细胞因子染色检测抗原Ag85B、HspX和PPD刺激后抗原特异的多功能CD4+T细胞标志。 （4）流式细胞术结合胞内细胞因子染色检测脾细胞抗原特异的免疫记忆 （5）CFSE标记法分析Ag85B肽特异的CD8+T细胞的CTL活性 结果: 1.成功构建过表达Ag85B和HspX蛋白的重组卡介苗rBCG::XB菌株，并通过RT-PCR证实其高表达Ag85B和HspX蛋白。 2. rBCG::XB给予机体更强而持久的保护性。 3. rBCG::XB诱导产生抗原特异的Th1型免疫应答。 4. rBCG::XB诱导产生抗原特异的单或多功能CD4+T细胞。 5. rBCG::XB诱导产生更高水平的CD4+记忆性T细胞。 6. rBCG::XB诱导产生更强而持久的Ag85B抗原特异的CTL活性和更高水平的CD8+记忆性T细胞。 结论: 1.共表达Ag85B和HspX多阶段抗原的rBCG::XB抗结核分枝杆菌感染的保护性强于BCG和仅表达单个抗原的重组卡介苗。 2.rBCG::XB增强的保护性与多阶段抗原特异的Th1型免疫应答和CTL效应的提高以及与长期保护相关的记忆性T细胞的增加有关。 3.rBCG::XB是结核病的一种很有前景的候选疫苗，需进一步评估其抗成人结核病的保护性。