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本研究克隆了拟南芥(Arabidopsisthaliana)甲醛脱氢酶(FALDH)基因ADH2的全长cDNA,以质粒pBA002为基础,构建了表达载体(命名为pBA-ADH2)。将该表达载体利用根癌农杆菌转化烟草叶块与菊花茎段。
主要研究结果如下:
1.根据已发表序列设计特异引物扩增拟南芥基因ADH2全长cDNA,并且在上下游引物引入SpeⅠ和XhoⅠ酶切位点,以质粒pBA002为基础,构建了表达载体pBA-ADH2,并将该表达载体转化根癌农杆菌EHA105,为后续的遗传转化提供条件。
2.农杆菌EHA105介导表达载体pBA-ADH2转化烟草叶块,在含有Basta的培养基上筛选获得烟草拟转基因植株。对其中6株拟转基因植株的基因组DNA进行AtADH2基因的PCR检测分析,初步证明了AtADH2基因已经完整地整合到上述T0代烟草中。
3.探讨了菊花转基因体系的条件及其优化。结果显示选择剂Basta在4mg/L时可以完全抑止菊花幼苗的分化,因此确定以4mg/LBasta做为筛选剂的浓度;头孢曲松钠对菊花幼苗的生长有着抑制作用,而羧苄青霉素对其不但没有抑制作用,反而还会刺激其分化,因此本研究采用400mg/L的羧苄青霉素作为脱菌抗生素的浓度;在1/2MS+IBA0.1mg/L的培养基中,菊花幼苗的生根状况较好。但由于本研究以茎段为转化外植体,在筛选培养时因农杆菌嵌入到茎段深层维管束难以除尽而导致转化失败。