旋毛虫病是一种呈世界性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是由于生食或半生食含旋毛虫肌幼虫（muscle larvae,ML）囊包的肉类所致。肠上皮是旋毛虫入侵宿主的第一道天然屏障,旋毛虫与肠上皮的直接接触并相互作用是旋毛虫建立感染的关键,但目前还不清楚旋毛虫侵入机制,需进一步深入研究。胰蛋白酶是蠕虫丝氨酸蛋白酶超家族的主要亚家族成员。丝氨酸蛋白酶可能在旋毛虫感染过程中发挥了重要的生物学功能,并且可能参与了旋毛虫对宿主各种组织成分的降解、幼虫的入侵和移行。近年来,通过蛋白质组学和免疫组学研究,在旋毛虫不同发育阶段的排泄/分泌（excretory/secretory,ES）抗原和表面抗原中发现了一些丝氨酸蛋白酶。旋毛虫肠道感染性幼虫（intestine infective larvae,IIL）和肠上皮细胞（intestinal epithelium cells,IECs）单层共培养后,IIL幼虫侵入IECs单层中并产生了一些丝氨酸蛋白酶作用于IECs单层,从而促进其侵入IECs单层。旋毛虫丝氨酸蛋白酶可能促进幼虫侵袭肠粘膜。然而,应用某些单一重组丝氨酸蛋白酶免疫小鼠仅诱导了对旋毛虫攻击感染的部分保护性免疫。因此,需要鉴定旋毛虫的其他丝氨酸蛋白酶,并评估它们引起的免疫保护作用。胰蛋白酶（trypsin）属于丝氨酸蛋白酶家族,具有消化、纤维蛋白溶解、发育、受精、凋亡和免疫的功能。本研究对旋毛虫胰蛋白酶（TsT,Genbank:XP＿003374437.1）采用分子克隆表达并纯化出了重组TsT（rTsT）,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）对TsT的表达与虫体定位进行了分析;应用抗rTsT小鼠血清进行体外侵入试验和体内动物实验。rTsT皮下免疫小鼠并检测该蛋白诱导的免疫应答类型和对小鼠的免疫保护效果,表明该蛋白可作为抗旋毛虫感染疫苗的候选靶标。材料与方法1.实验动物及旋毛虫虫种实验小鼠为昆明小鼠和BALB/c小鼠;旋毛虫为河南猪源地理株（虫种ISS534）;实验所用的表达质粒为p QE-80L;表达菌株为BL21;细胞为小鼠小肠上皮细胞。2.TsT的生物信息学分析利用生物学分析网站对TsT（Genbank:XP＿003374437.1）进行理化性质分析。在Ex Pasy网站预测TsT的分子量大小、p I和疏水性;在Signal P-5.0网站进行TsT信号肽预测;在TMHMM Server v.2.0网站预测TsT的跨膜结构;Target P-2.0 Server网站进行TsT亚细胞定位分析;在SWISS-MODEL网页预测TsT的二级和三级结构;在Bcepred网站上预测TsT的B细胞表位;应用Bio Edit软件将旋毛虫TsT与其他种或基因型旋毛虫及其他寄生虫的序列进行比对;应用MEGA 7的临接法进行1000次重复计算绘制TsT系统发育进化树。3.TsT的分子克隆表达及抗原性分析将TsT基因连接至克隆载体p MD19-T中,经PCR和酶切鉴定后送测序;选择测序结果正确的菌株进行双酶切后,将TsT目的片段连接到表达载体p QE-80L,构建TsT的重组表达质粒p QE-80L/TsT,通过大肠杆菌表达rTsT,镍柱亲和层析后,应用rTsT免疫小鼠制备抗rTsT小鼠血清,收集旋毛虫ML可溶性粗抗原和ES抗原,进行SDS-PAGE和Western blot,分析rTsT的抗原性。4.TsT在旋毛虫不同虫期的表达及其免疫荧光定位收集不同虫期的虫体,通过RT-PCR分析TsT基因在旋毛虫不同虫期（ML、IIL、3 d成虫（adult worm,AW）和新生幼虫（newborn larvae,NBL））的转录。应用IFA观察TsT在旋毛虫不同发育期虫体的表达情况及其在旋毛虫虫体的组织定位情况。5.rTsT与IECs的结合及其在旋毛虫侵入过程中的功能检测采用Far-Western和ELISA方法来检测rTsT与小鼠IECs的结合。通过幼虫体外侵入试验进一步观察rTsT和抗rTsT小鼠血清对旋毛虫侵入IECs的促进或抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用试验（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）评价抗rTsT血清对NBL的杀伤作用。6.rTsT诱导的免疫应答的检测及免疫保护效果的评价将90只BALB/c雌性小鼠分为3组（30只/组）,分别用rTsT、ISA 201佐剂或磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）进行皮下注射。rTsT（20μg/只）免疫接种小鼠,间隔2周免疫1次,共免疫4次。收集免疫后0、2、4、6及8周的血清并检测小鼠血清特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a的抗体水平,以及免疫后肠液中总的s Ig A和rTsT特异性s Ig A水平;收集免疫小鼠的脾细胞和肠系膜淋巴结细胞,加入rTsT蛋白刺激后在37℃培养72 h,采用双抗体夹心ELISA法检测rTsT蛋白免疫前后脾细胞和肠系膜淋巴结细胞产生的细胞因子（IFN-γ和IL-4）水平的变化。在末次免疫后2周,对每只小鼠用300条旋毛虫攻击感染,在感染后5 d与30 d,分别收集免疫小鼠的肠道AW和ML,计数并计算减虫率,以评价rTsT的免疫保护效果。7.统计学处理使用SPSS 21.0统计分析软件对数据进行统计分析。主要采用t检验、单因素方差分析和卡方检验,数值表述为?x±SD,检验显著性水平:α=0.05。结果1.TsT生物信息学分析旋毛虫胰蛋白酶TsT基因序列全长为891 bp,编码296个氨基酸残基,分子量为33 k Da,p I为9.42。该蛋白有信号肽,无跨膜区,N端有明显的疏水性区域,亚细胞定位表明TsT属于分泌型蛋白,有良好的抗原性以及完整的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的结构域。二级结构预测显示TsT有3个α螺旋、16个β折叠和20个无规则卷曲;三级结构预测结果表明TsT具有3个活性位点,分别是组氨酸（Histidine,His）、丝氨酸（Serine,Ser）和天冬氨酸（Aspartic acid,Asp）。2.TsT的克隆表达及抗原性分析SDS-PAGE结果显示,发现诱导的重组菌在30.9 k Da处有一条蛋白带,可溶性分析该蛋白主要在沉淀中,以包涵体的形式存在。Western blot分析显示,rTsT蛋白能够被抗His单抗与感染小鼠血清识别,但不被正常小鼠血清识别,说明该重组蛋白为旋毛虫胰蛋白酶rTsT且具有良好的抗原性。3.TsT在旋毛虫不同虫期的表达及其免疫荧光定位RT-PCR分析结果表明,TsT基因在旋毛虫不同虫期（ML、IIL、AW和NBL）均有转录,IFA显示TsT主要在5 d、6 d成虫期皮层表达,IFA结果显示,TsT定位在虫体切面及雌成虫胚胎。4.Far-Western和ELISA检测rTsT与IECs的结合IECs蛋白与rTsT孵育后,抗rTsT小鼠血清能够识别,感染小鼠血清作为阳性对照也能识别,但正常小鼠血清无法识别;rTsT能够与经SDS-PAGE分离后的小鼠IECs蛋白的10条带结合,说明rTsT能与IECs发生相互作用,而rTsT不能与C2C12蛋白结合,表明rTsT与IECs蛋白的结合具有特异性。ELISA检测结果亦表明,rTsT能与IEC蛋白结合,这种结合具有rTsT与IECs蛋白剂量依赖性,ELISA的光密度（optical density,OD）值随着IECs蛋白浓度的升高而增加（F=356.446,P<0.001）,且具有IECs蛋白量依赖性（r=0.874,P<0.001）;当IECs蛋白与不同浓度的rTsT进行孵育时,OD值随着rTsT蛋白浓度的升高而增加（F=498.378,P<0.001）,OD值与rTsT蛋白浓度具有相关性（r=0.981,P<0.001）。5.幼虫体外侵入IECs将rTsT与IECs及旋毛虫IIL幼虫在半固体培养基中共培养2 h后观察结果,rTsT组和牛血清白蛋白（Bull serum albumin,BSA）组的幼虫侵入率分别为89.94%和76.17%（χ²=6.771,P<0.001）,rTsT对IIL幼虫侵入IECs具有明显的促进作用,这种促进侵入作用具有rTsT剂量相关性（r=0.987,P<0.001）,随着rTsT蛋白浓度的增加,促进作用明显增强（F=12.749,P<0.001）。然而,BSA对IIL侵入IECs没有促进作用。将rTsT与IECs及旋毛虫IIL幼虫在半固体培养基中共培养2 h后,发现抗rTsT小鼠血清组、感染小鼠血清组和正常小鼠血清组的幼虫侵入率分别为49.52%、42.19%和79.14%（χ²=37.376,P<0.001）。表明抗rTsT免疫血清对旋毛虫侵入IECs具有显著的抑制作用。rTsT免疫血清对幼虫侵入IECs的抑制作用具有抗rTsT抗体剂量依赖性（r=0.980,P<0.001）,且随着血清稀释度的增加呈下降趋势（F=809.173,P<0.001）。6.rTsT蛋白诱导的免疫应答经过第2次和第3次皮下免疫后,rTsT蛋白组的Ig G抗体水平明显上升,但是ISA201佐剂组和PBS组的抗体水平的差异无统计学意义（P>0.05）;rTsT蛋白免疫后4、6及8周,Ig G1抗体水平明显高于Ig G2a(t_4w=7.327,t_6w=5.961,t_8w=20.751,P<0.001),表明rTsT免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。此外,在末次免疫后,rTsT组的总Ig A和TsT特异性s Ig A与免疫前相比较均有明显升高。3组小鼠肠液中特异性s Ig A水平的差异具有显著的统计学意义（F=16.042,P<0.001）,rTsT蛋白免疫组明显高于ISA 201组和PBS组（t₁=3.776,t₂=4.452,P<0.001）。rTsT免疫小鼠的脾细胞和肠系膜淋巴结细胞经rTsT蛋白刺激后,所产生的细胞因子（IFN-γ和IL-4）水平明显上升(脾脏-t_IL-4=6.093,P<0.01;t_IFN-γ=4.275,P<0.01;MLN-t_IL-4=7.81,P<0.001;t_IFN-γ=7.911,P<0.001)。在免疫后8周,rTsT免疫小鼠的脾（spleen,sp）细胞和肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node,MLN）细胞所产生的细胞因子（IFN-γ和IL-4）水平,明显高于佐剂组和PBS组(脾脏-F_IL-4=34.396,P<0.001;F_IFN-γ=13.27,P<0.01;MLN-F_IL-4=55.767,P<0.001;F_IFN-γ=54.738,P<0.001)。7.抗rTsT抗体介导的ADCC对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用在含有小鼠腹腔巨噬细胞的培养板中分别加入不同的血清（抗rTsT小鼠血清、感染小鼠血清和正常小鼠血清）和NBL,通过ADCC作用后不同时间,观察抗rTsT抗体介导的ADCC对旋毛虫NBL的杀伤作用。结果显示,当血清稀释度为1:100时,抗rTsT小鼠血清对NBL的细胞毒性为21.97%,明显高于正常小鼠血清的8.97%（χ²=6.733,P<0.01）。新生幼虫的死亡率随着抗体稀释度的增加逐渐下降（F=101.254,r=-0.880,P<0.001）;随着孵育时间的延长,NBL死亡率逐渐上升（F=88.941,r=0.993,P<0.001）。8.rTsT免疫对小鼠的免疫保护效果rTsT免疫小鼠用旋毛虫攻击感染后5 d与30 d,肠道成虫减虫为33.17%（F=79.988,P<0.001）,肌幼虫减虫率为37.8%（F=8.683,P<0.001）。结论1.构建了旋毛虫胰蛋白酶（TsT）重组表达质粒p QE-80L/TsT,并成功表达纯化了rTsT。2.TsT在旋毛虫各期均有转录,但主要在5-6天的成虫期表达,定位于虫体皮层和雌虫胚胎。3.TsT能够与小鼠IECs特异性结合,对旋毛虫侵小鼠IECs具有促进作用。抗rTsT抗体能够抑制幼虫的侵入,且可介导巨噬细胞对NBL的杀伤作用。4.rTsT皮下免疫小鼠后诱导了全身性Th1/Th2混合型免疫应答,可产生对旋毛虫感染的部分免疫保护作用,表明TsT可作为抗旋毛虫疫苗的一种候选分子靶标。