目的建立人乳腺癌多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)、阿霉素(Adriamycin，Adr)耐药细胞模型，描述两者生物学特性，探讨其获得性耐药的潜在分子机制；应用miRNA（微小RNA）微阵列技术筛选人乳腺癌多西紫杉醇耐药株、阿霉素耐药株及亲本细胞间的miRNA差异表达谱，并通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)进行确认，为进一步研究miRNA调控在耐药形成中的作用奠定基础。方法1.以人乳腺癌敏感细胞MCF-7为亲本细胞(MCF-7/S)，在体外采用低浓度逐步加量诱导法，分别建立多西紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/Doc)和阿霉素耐药细胞株(MCF-7/Adr)；双目倒置显微镜观察并记录细胞在获得耐药性过程中的形态学变化；采用胎盼蓝细胞计数法进行生长曲线绘制和群体倍增时间测定；采用MTT法测定敏感及耐药细胞株对各种抗肿瘤药物的敏感程度；流式细胞术(FCM)检测敏感及耐药细胞株周期分布的变化；采用Western blot检测敏感及耐药细胞株表面标志雌激素受体(ER)的表达变化；RT-qPCR和Western blot检测耐药细胞株系列多药耐药相关基因如转运体MDR1/P-gp、MRP1和BCRP，代谢酶CYP3A4和GST pi，修复基因Topo IIα，以及凋亡基因Bcl-2及Bax的mRNA和蛋白的表达。2.采用miRNA微阵列分析筛选出乳腺癌敏感株、多西紫杉醇耐药株、阿霉素耐药株中差异表达的微小RNA，差异倍数≥2或≤0.5被认为有统计学意义；应用RT-qPCR对其中15个在MCF-7/Doc及MCF-7/Adr中均上调或下调的miRNAs进行验证。结果1.经16个月的诱导，建立的MCF-7/Doc可在含200nM Doc培养液中稳定生长。光镜下观察，经多西紫杉醇处理后诱导中的细胞变圆、变小、凸起、核分裂像减少；MTT显示，MCF-7/Doc耐药指数为敏感细胞MCF-7/S的37倍，对其他多种化疗药物呈不同程度的交叉耐药状态。MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长(41.6h vs30.6h；P<0.01)。与亲本MCF-7/S相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加，S期减少；MDR1/P-gp、MRP1、BCRP、CYP3A4、Bcl-2基因和蛋白表达水平上调，Topo IIα及Bax基因和蛋白表达下调，而ER阳性表达丢失。2.经16个月的诱导，建立的MCF-7/Adr可在含1500nM Adr培养液中稳定生长。光镜下观察，经阿霉素处理后诱导中的细胞变大、胞核肿胀、颗粒感明显、核分裂像减少；MTT显示，MCF-7/Adr耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的274倍，对其他多种化疗药物呈不同程度的交叉耐药状态。MCF-7/Adr倍增时间较MCF-7/S延长(33.8h vs30.6h；P<0.05)。与亲本MCF-7/S相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加，S期减少；MDR1/P-gp、MRP1、BCRP、GST pi、Bcl-2基因和蛋白表达水平上调，Topo IIα及Bax基因和蛋白表达下调，而ER阳性表达丢失。3. MiRNA微阵列结果显示：与亲本MCF-7/S相比，多西紫杉醇耐药株中33个miRNAs上调，53个下调；阿霉素耐药株中84个miRNAs上调，100个下调；其中在两种耐药株中均上调的miRNAs有11个，均下调的有27个。两种耐药株之间进行比较，也有165个miRNAs存在着表达差异。挑选15个在两株耐药细胞中有一致性改变的miRNAs，其RT-qPCR验证结果与芯片结果相符合。结论1.建立的MCF-7/Doc、MCF-7/Adr耐药细胞株具有典型的多药耐药特性，可用于耐药机制的研究。2. MCF-7/S获得性多西紫杉醇或阿霉素耐药的过程均比较复杂，涉及多个基因或多条通路。MCF-7/Doc和MCF-7/Adr耐药细胞，既存在着部分共同的、也存在着各自药物所特有的诱发机制。3. MCF-7/S、MCF-7/Doc和MCF-7/Adr细胞间存在着明显的miRNA表达差异，提示miRNA可能在耐药获得中有重要调控作用，值得进一步研究。