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免疫活性T细胞是哺乳动物适应性免疫过程中的关键免疫因子,而T细胞的活化伴随着T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号通路激活等一系列复杂过程,但是目前关于鱼类TCR信号通路的研究还十分有限。TCR信号通路的启动依赖于膜TCR共受体(例如CD4/8、CD3和CD45)与抗原识别后将胞外的激活信号传导至胞内,由于TCR本身没有固有的酶活性,而是需依赖一系列蛋白酪氨酸激酶(如LCK、PKCθ、ZAP70)的活性和其他下游信号分子的相互作用来启动下级的信号转导。杂交鳢(斑鳢Channa maculata♀×乌鳢Channa argus♂)是我国特色经济鱼类之一,近年来,由鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)和舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)引起的“结节病”和“类结节病”已对鳢科鱼类养殖造成极大的损害,大量的实验表明,杂交鳢在病原菌感染后能产生获得性免疫,但具体的免疫应答机制尚不清楚。本文通过克隆获得杂交鳢6个TCR相关基因(LCK、ZAP-70、GRB2、RasGRP1、RAF和PKCθ)的完整开放阅读框(ORF),并利用实时荧光定量PCR检测分析6个基因在健康杂交鳢组织中的分布情况及其分别对舒伯特气单胞菌和鰤诺卡氏菌感染后的免疫应答特性;构建6个真核表达重组质粒pEGFP-N1-(LCK、ZAP-70、GRB2、RasGRP1、RAF和PKCθ)分别转染HEK293T细胞,通过激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的分布情况;成功构建5个真核表达重组质粒pEGFP-N1-(LCK#、ZAP-70#、GRB2#、RAF#和PKCθ#),通过双荧光素酶报告基因检测其过表达对NF-κB和AP-1活性的影响。试验结果显示:(1)成功克隆获得CmaLCK、CmaZAP-70、CmaGRB2、CmaRasGRP1、CmaRAF和CmaPKCθ基因的完整ORF,其长度分别为1506 bp、1818 bp、654 bp、2394 bp、1914 bp和2151 bp,分别编码501、605、217、797、637和716个氨基酸。6个基因编码的蛋白序列、结构特征及关键位点均与哺乳动物及其他硬骨鱼类的相应蛋白具有较高的同源性,说明其在生物进化过程中相对保守。(2)荧光定量PCR结果表明,CmaLCK、CmaZAP-70、CmaGRB2、CmaRasGRP1、CmaRAF和CmaPKCθ基因均能在健康杂交鳢的脾脏、头肾、肝脏、胸腺、心脏、肠、肌肉、皮肤、鳃和血液等10个组织中表达但存在差异,于免疫组织胸腺、脾脏和头肾的表达量丰富,在肝脏中也有较高的表达。(3)两种病原菌(舒伯特气单胞菌和鰤诺卡氏菌)分别感染杂交鳢后,6个基因在脾脏和头肾及肝脏组织中表达总体出现不同程度的上调,其中CmaLCK、CmaZAP-70、CmaGRB2和CmaRasGRP1在免疫组织脾脏和头肾中的表达变化更加显著,CmaRAF和CmaPKCθ在肝脏的表达量变化也较明显。杂交鳢对舒伯特气单胞菌感染后的应答比鰤诺卡氏菌感染要迅速强烈,这可能与病原菌的生理特性相关。整体暗示着杂交鳢TCR相关的6个基因可能在T细胞增殖活化、信号转导和抵御病原菌感染过程中发挥关键作用。(4)亚细胞定位结果显示LCK、ZAP-70、GRB2、RasGRP1、RAF和PKCθ均在HEK293T细胞质中呈零散点状分布,ZAP-70在细胞核中也有表达。(5)双荧光素酶报告基因结果显示pEGFP-N1-LCK#、pEGFP-N1-ZAP70#和pEGFP-N1-GRB2#在HEK293T细胞的过表达均能够显著增强转录因子NF-κB和AP-1的活性,暗示着NF-κB和AP-1信号均被激活。pEGFP-N1-RAF#的过表达对NF-κB的活性无显著的增强作用,而对AP-1的活性有一定促进作用。pEGFP-N1-PKCθ#对转录因子NF-κB和AP-1信号均有一定的促进作用,但影响不显著。综合本文结果推测这6个基因在防御病原菌感染应答及参与调控信号转导过程中发挥重要作用,为更深入了解鱼类TCR信号通路抗感染机制提供了理论基础。