第一部分:M-NPs的制备与鉴定目的:合成具有巨噬细胞膜功能的M-NPs,为后续实验的成功开展奠定基础。方法:将RAW264.7巨噬细胞通过物理破碎后用梯度离心的方法获取细胞膜,再进行后续实验证明巨噬细胞膜是否提取成功。已知F4/80、TLR4、CD206以及CD11c均是巨噬细胞外膜的表面标志物,LaminA/C是细胞核的标志物。后续实验主要有:(1)采用Western blot实验检测细胞匀浆(Hom)、细胞膜(Mem)、细胞核(Nuc)中F4/80、TLR4、CD206、CD11c以及LaminA/C的蛋白表达便可知道细胞膜提取是否成功;(2)通过改良的双乳化挥发方法制备PLGA纳米颗粒;(3)将提取的巨噬细胞膜与PLGA纳米粒按一定比例混合,在通过脂质体挤出机反复挤压合成巨噬细胞膜包被的纳米粒(M-NPs);(4)透射电镜检测巨噬细胞膜、PLGA纳米粒以及M-NPs的形态和直径;(5)Western blot实验检测M-NPs中F4/80、TLR4、CD206、CD11c以及LaminA/C的蛋白表达。结果:(1)将巨噬细胞通过物理破碎后用梯度离心的方法可获取纯度较高的细胞膜,提取的细胞膜在透射电镜下呈透明的碎片;(2)电镜下观察到合成的PLGA纳米颗粒呈直径为171.4±17.3 nm的球形颗粒;(3)电镜下观察到合成的M-NPs由PLGA微球核心和外层的细胞膜组成,直径为214.1±18.6 nm;(4)Western blot实验显示细胞匀浆中F4/80、TLR4、CD206、CD11c以及LaminA/C的蛋白均有表达。细胞膜中仅表达F4/80、TLR4、CD206和CD11c,不表达LaminA/C,说明提取的细胞膜纯度高。细胞核中仅表达LaminA/C,不表达其他细胞膜表面标记物蛋白;(5)M-NPs中表达F4/80、TLR4、CD206和CD11c,而不表达LaminA/C。以上结果说明提取的细胞膜纯度高,并成功制备M-NPs。结论:本部分证实PLGA纳米粒能被巨噬细胞膜包裹,形成巨噬细胞膜包被的纳米粒。第二部分:M-NPs减轻LPS介导的巨噬细胞活化的机制研究目的:体外探索M-NPs对LPS介导的巨噬细胞活化的影响及分子机制。方法:用第一部分的方法提取RAW264.7巨噬细胞膜、制备PLGA纳米粒、合成及鉴定M-NPs。再将生长状态良好的RAW264.7巨噬细胞分为6组,每组细胞均用150 ng/ml的LPS处理24 h,再分别用浓度为0、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0mg/ml的M-NPs处理细胞24 h。提取各组细胞的总蛋白,Western blot实验检测MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达;ELISA实验检测了各组细胞上清液中残余LPS含量以及上清液中促炎因子TNF-α、IL-6的含量;CCK-8实验检测不同浓度的NPs和M-NPs(0、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/ml)对RAW264.7细胞生长活性的影响以研究M-NPs是否对细胞具有毒性作用。用质粒转染的方式沉默或过表达RAW264.7细胞膜上的TLR4受体,质粒转染细胞72 h后,荧光显微镜下观察质粒的转染率,Western blot以及RT-qPCR分别检测TLR4的蛋白和核酸表达。质粒转染成功后,提取普通巨噬细胞、沉默TLR4巨噬细胞和过表达TLR4巨噬细胞的细胞膜,制备M-NPs、沉默TLR4的M-NPs(TLR4~-/M-NPs)以及过表达TLR4的M-NPs(TLR4~+/M-NPs),并将生长状态良好的RAW264.7细胞分为6组:空白对照组;M-NPs组;LPS组;LPS+M-NPs组;LPS+TLR4~+/M-NPs组;LPS+TLR4~-/M-NPs组。其中空白对照组不做任何处理;M-NPs组:用1 mg/ml M-NPs处理细胞24 h;LPS组:用150 ng/mL LPS处理细胞24 h;LPS+M-NPs组:用150 ng/mL LPS处理细胞24 h后再用1 mg/ml M-NPs处理细胞24 h;LPS+TLR4~+/M-NPs组:用150 ng/mL LPS处理细胞24 h后再用1 mg/ml TLR4~+/M-NPs处理细胞24 h;LPS+TLR4~-/M-NPs组:用150 ng/mL LPS处理细胞24 h后再用1 mg/ml TLR4~-/M-NPs处理细胞24 h。处理完成后提取各组细胞总蛋白并收集细胞上清液进行后续实验:(1)Western blot实验检测MyD88、IRAK1、p-p65和p65的蛋白表达;(2)ELISA实验检测上清液中残余LPS的含量。为了进一步检测不同浓度TLR4~+/M-NPs和M-NPs与上清液残余LPS相关性,将RAW264.7巨噬细胞用150 ng/mL LPS处理24 h后再用不同浓度的TLR4~+/M-NPs或M-NPs处理细胞24 h,收集各组细胞上清液,ELISA检测上清液LPS含量。结果:(1)用质粒转染的方式沉默或过表达RAW264.7巨噬细胞膜上的TLR4受体,质粒转染的效率高,沉默或过表达TLR4效果明显;(2)M-NPs可以有效抑制炎症信号因子MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达,并随着M-NPs浓度的升高,抑制效果越明显;(3)随着M-NPs浓度的升高,细胞上清液中残余LPS含量越低,在M-NPs浓度为2 mg/ml时,上清液中残余LPS接近最低水平;(4)随着NPs和M-NPs浓度的升高,对细胞生长的抑制作用越明显,当NPs和M-NPs浓度超过3 mg/ml时,对细胞的生长具有显著的抑制作用(P<0.05);(5)与LPS组相比,M-NPs组MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达水平降低,提示M-NPs抑制LPS介导的巨噬细胞炎症信号通路的激活(P<0.05);(6)与M-NPs组相比,TLR4~+/M-NPs组MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达水平更低,提示TLR4~+/M-NPs可以更有效抑制LPS介导的炎症通路的激活(P<0.05);(7)沉默TLR4(TLR4~-/M-NPs组),M-NPs对LPS介导的炎症的抑制作用减弱或消失;(8)在TLR4~+/M-NPs和M-NPs浓度小于3 mg/ml时,中和同等量的LPS,TLR4~+/M-NPs所需的浓度显著低于M-NPs的浓度,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)M-NPs可以中和LPS减少LPS与TLR4的结合,通过抑制TLR4/MyD88/IRAK1/p-p65炎症信号通路,抑制TNF-α和IL-6炎症因子的释放,减轻炎症反应;过量使用M-NPs存在潜在的细胞毒性作用。(2)体外过表达巨噬细胞膜TLR4再合成TLR4~+/M-NPs,在中和同等剂量LPS时,可以有效减少纳米材料的用量,进而更有效降低过量使用纳米材料带来的潜在毒性作用。第三部分:M-NPs减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制研究目的:探讨M-NPs对大鼠肝移植术后缺血再灌注损伤的影响及分子机制。方法:为了研究M-NPs在大鼠体内的分布情况,将15 mg/kg带红色荧光探针的NPs或M-NPs通过尾静脉注射的方式分别注入到SD大鼠体内,24 h后检测纳米粒在大鼠体内的分布。采用双袖套法建立SD大鼠肝移植模型,将30只SD大鼠随机分为6组,每组5只,分别为空白对照组(Blank);单纯肝移植组(Con);肝移植+NPs组(NPs);肝移植+M-NPs组(M-NPs);肝移植+TLR4~+/M-NPs组(TLR4~+/M-NPs);肝移植+TLR4~-/M-NPs组(TLR4~-/M-NPs)。Blank组大鼠不做任何处理;Con组大鼠仅做肝移植;其他组在肝移植成功后通过尾静脉注入20 mg/kg对应的纳米材料。4天后,采集各组大鼠外周血并取下肝、心、脾、肺、肾进行以下研究:(1)HE染色检测心、肝、脾、肺、肾的病理改变;(2)检测血清ALT和AST的水平;(3)ELISA检测血清LPS水平。接着使用不同浓度M-NPs或TLR4~+/M-NPs注入肝移植大鼠体内,检测血清中LPS含量。再研究不同浓度的NPs或M-NPs对肝移植大鼠生存的影响。取60只肝移植成功的SD大鼠随机分为两大组,每组30只。每个大组随机分为6个小组,每组5只大鼠,通过尾静脉注射的方式将不同浓度的NPs(0、50、100、150、200、250 mg/kg)或M-NPs(0、50、100、150、200、250 mg/kg)注入大鼠体内,连续观察6天,统计大鼠的生存情况。用同样方法将30只SD大鼠随机分为6组,每组5只,分别为空白对照组(Blank);单纯肝移植组(Con);肝移植+NPs组(NPs);肝移植+M-NPs组(M-NPs);肝移植+TLR4~+/M-NPs组(TLR4~+/M-NPs);肝移植+TLR4~-/M-NPs组(TLR4~-/M-NPs)。分别提取上述6组大鼠肝脏的KCs后进行后续实验:(1)Western blot检测了KCs中MyD88、IRAK1、p-p65和p65的蛋白表达;(2)RT-qPCR检测了KCs中炎症因子TNF-α和IL-6的核酸水平;(3)ELISA实验检测了大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平。结果:(1)NPs或M-NPs主要分布在大鼠肝脏,其次是脾脏,其他器官,如心脏、肾脏以及肺中的表达很低;(2)与Blank组相比,肝移植(Con组)显著加重了大鼠心、肝、脾、肺、肾的病理损伤,主要体现在器官正常的结构纹理改变和大量炎症细胞浸润;(3)肝移植后单纯注射NPs(NPs组)对肝移植导致的各个脏器的损伤无显著影响;(4)M-NPs组大鼠心、肝、脾、肺、肾的病理改变较Blank组显著减轻,TLR4~+/M-NPs对肝移植术后各脏器的保护效果显著高于M-NPs组,TLR4~-/M-NPs对大鼠各脏器无显著保护作用;(5)血清ALT和AST的改变与HE染色的结果一致,M-NPs可以改善因肝移植导致的大鼠肝功能异常,而TLR4~+/M-NPs对大鼠肝功能的改善效果显著优于M-NPs组,TLR4~-/M-NPs对大鼠肝功能无显著保护作用;(6)血清中LPS的改变也和HE染色结果一致,即M-NPs可以显著降低肝移植大鼠血清LPS水平,TLR4~+/M-NPs的降低效果较M-NPs更显著,差异具有统计学意义(P<0.05);(7)肝移植大鼠血清LPS降低到最低水平所需M-NPs约为30 mg/kg或TLR4~+/M-NPs约为20 mg/kg,均未达到安全阈值(100 mg/kg),且肝移植大鼠血清中LPS降低到同等水平所需TLR4~+/M-NPs的用量显著低于M-NPs(P<0.05);(8)与单纯肝移植组相比,M-NPs组KCs中MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达显著降低(P<0.05),提示M-NPs可有效抑制肝移植大鼠KCs的活化;(9)与M-NPs组相比,TLR4~+/M-NPs组KCs中MyD88、IRAK1和p-p65的蛋白表达显著降低(P<0.05),提示TLR4~+/M-NPs比M-NPs更有效抑制肝移植大鼠KCs的活化。KCs中TNF-α和IL-6的核酸水平以及血清中TNF-α和IL-6的水平与Western blot的结果相似,差异具有统计学意义(P<0.05))。结论:(1)注入大鼠机体后的M-NPs主要分布在其肝脏中。(2)M-NPs通过中和内毒素减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤,而且通过体外过表达TLR4的TLR4~+/M-NPs可以更有效减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤。(3)M-NPs可通过抑制KCs炎症因子的表达和分泌,抑制抑炎因子的分泌,进而减轻肝移植缺血再灌注损伤,而且TLR4~+/M-NPs的抑炎效果比M-NPs更明显。