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目的:本课题探讨子宫内膜再生细胞(ERC)在溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型中免疫调节的作用及相关机制。自经血中分离鉴定ERC,观察其表面程序性死亡受体-配体1(PD-L1)的表达情况;建立UC的小鼠动物模型;探讨ERC在UC小鼠模型体内的分布情况;将ERC应用于UC的体内体外实验,研究ERC细胞表面的PD-L1免疫调节分子在UC治疗中的作用。方法:1)以月事杯收集健康育龄期女性志愿者的月经血,利用标准的Ficoll方法分离月经血样品中的单个核细胞,进行细胞培养,应用流式细胞术鉴定ERC的表面抗原。2)选用SPF级的BALB/c小鼠,将其饮用不同浓度的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液建立UC小鼠动物模型,观察造模期间实验动物的一般情况、疾病活动指数(DAI)及组织病理学改变,选择最佳的DSS浓度并对小鼠动物模型进行评估。3)应用PKH26(Paul Karl Horan 26)对ERC进行体外标记,将标记后的ERC应用于UC动物模型,观察ERC在UC动物模型体内的分布情况。4)应用PD-L1抗体对ERC细胞表面的PD-L1进行封闭,在体内实验中,将ERC及PD-L1抗体封闭后的ERC应用于UC动物模型(分为四组,(1)正常对照组:自由饮用不含DSS的饮用水;(2)未治疗组:自由饮用3%DSS溶液+经静脉注射PBS缓冲液;(3)ERC组:自由饮用3%DSS溶液+静脉注射以PBS缓冲液重悬的ERC;(4)PD-L1封闭的ERC组:自由饮用3%DSS溶液+静脉注射以PBS缓冲液重悬的PD-L1封闭的ERC),第2、5、8天,ERC组经尾静脉注射ERC(1×106/0.2ml/只),PD-L1封闭的ERC组经尾静脉注射PD-L1封闭的ERC(1×106/0.2ml/只),第8天,所有组均改为饮用水,实验期间每天观察并记录各组实验动物的一般状况,进行DAI评分,第15天,处死全部小鼠,测量自然状态下结直肠长度,显微镜下观察结直肠的病理改变,采用流式细胞术检测脾脏CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T、CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs、CD11c~+MHC-II~+DCs、F4/80~+M、F4/80~+CD206~+M细胞数量;采用ELISA及q PCR的方法检测结直肠正常组织及病变组织TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-β的蛋白水平及m RNA转录水平。在体外实验中,从正常小鼠中分离脾细胞,将ERC与脾细胞进行共培养或者将PD-L1封闭的ERC与脾细胞进行共培养,应用不同的细胞刺激因子对脾细胞进行刺激(分为四组,(1)未治疗组:单纯脾细胞培养;(2)ERC治疗组:ERC与脾细胞进行共培养;(3)PD-L1封闭的ERC治疗组:PD-L1封闭的ERC与脾细胞进行共培养;(4)transwell培养组:ERC与脾细胞进行非接触的共培养),应用流式细胞术分析不同组中CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T、CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs、CD11c~+MHC-II~+DCs、F4/80~+M、F4/80~+CD206~+M细胞的数量;分析上述指标的变化,评价PD-L1在ERC治疗小鼠UC中的作用。结果:1)ERC能够表达PD-L1、CD90、CD105,不表达CD34、CD45;随着刺激因子IFN-γ浓度的增加,ERC表面的PD-L1表达相应增加。2)随着DSS浓度的增加及造模时间的延长,造模小鼠的一般状况逐渐变差、进食进水逐渐减少、体重逐渐下降、DAI评分逐渐增加,小鼠的病死率增加,其病理学改变包括:粘膜固有层中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的浸润,腺窝扭曲变形,固有层增厚,粘膜下层淋巴滤泡形成,小鼠肠道的炎症逐渐加重。3)将PKH26荧光标记的ERC于造模第5天经尾静脉注入UC小鼠动物模型体内,在ERC注入48h时进行组织取材,荧光显微镜观察显示荧光强度为肺脏>肝脏>脾脏>结肠组织,肾脏没有观察到荧光,模型组结直肠病变组织荧光强度高于正常组结直肠组织的荧光强度。4)体内实验显示,尾静脉注射ERC对小鼠结直肠炎症有明显的保护作用,封闭ERC表面的PD-L1明显降低ERC对小鼠的结直肠炎症保护作用;与未治疗组比较,ERC组脾脏CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T细胞数量明显减少(P<0.05),CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs细胞数量明显增加(P<0.05),CD11c~+MHC-II~+DCs细胞数量显著减少(P<0.05),F4/80~+M细胞数量明显减少(P<0.05),F4/80~+CD206~+M相对增加(P<0.05),结直肠病变组织内TNF-α、IFN-γ的m RNA转录水平及蛋白表达水平降低(P<0.05),IL-10、TGF-β的m RNA转录水平及蛋白表达水平升高(P<0.05);与ERC组相比,PD-L1封闭的ERC治疗组脾脏CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+细胞数量相对增加(P<0.05)、CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs细胞数量相对减少(P<0.05)、CD11c~+MHC-II~+DCs细胞数量相对增加(P<0.05),结直肠组织内TNF-α、IFN-γ的m RNA转录水平及蛋白表达水平相对增加(P<0.05),IL-10、TGF-β的m RNA转录水平及蛋白表达水平相对减少(P<0.05)。体外实验显示,与正常对照组相比,经不同的刺激因子刺激后,ERC共培养组CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T、CD11c~+MHC-II~+DCs、F4/80~+M细胞数量相对减少,CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs、F4/80~+CD206~+M细胞数量相对增加;PD-L1封闭的ERC共培养组与ERC共培养组相比,CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T、CD11c~+MHC-II~+DCs、F4/80~+M细胞数量相对增加,CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs、F4/80~+CD206~+M细胞数量相对减少;transwell培养组与ERC共培养组相比,CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T、CD11c~+MHC-II~+DCs、F4/80~+M细胞数量相对增加,CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs、F4/80~+CD206~+M细胞数量相对减少。结论:1)自经血中分离的ERC是一种类似于MSC的再生细胞,ERC不但来源丰富、获取无创,而且ERC表面表达在诱导免疫耐受方面发挥重要作用的免疫调节分子PD-L1。2)3%的DSS为构建BALB/c小鼠UC动物模型的理想浓度,该浓度不但能够很好的模拟人UC肠道病理改变,而且没有小鼠的病死发生。3)将ERC通过小鼠尾静脉注入UC模型小鼠体内后,ERC能够向肠道炎症部位迁移,而且ERC在肠道的分布高于正常对照组。4)PD-L1在ERC有效控制UC动物模型肠道炎症的发生发展中发挥重要作用,体内体外实验均显示ERC通过PD-L1抑制DCs的成熟分化及CD4~+T和CD8~+T细胞的增殖、促进Tregs细胞及M2细胞的产生,并且体外实验中还显示ERC表面的PD-L1通过直接接触的方式起作用,进而发挥免疫调节的作用。