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实验目的： 肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC；旧称储脂细胞、Ito细胞）位于肝窦的内皮下腔Disse腔，储藏人体内80％-90％的维生素A，具有多种生物功能。目前认为，HSC是肝纤维化时细胞外基质的主要来源细胞，是肝纤维化形成的关键。其活化是一个从形态到功能改变的复杂等过程。体外实验结果表明：在正常肝脏基质成分上培养的HSC可保持长一段时间处于静止状态，而在Ⅰ型胶原上培养时，HSC可被激活，表明细胞周围ECM成分改变，有效调节HSC功能，包括维生素A的代谢、HSC细胞的形态、增殖和胶原合成等。 基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）是降解细胞外基质的主要酶系。近年来，MMPs在肝纤维化、肝硬化中的作用越来越受到重视。MMPs家族中主要成员MMP-2主要是由HSC产生的，MMP-2的活化、表达与肝纤维化进展相平行，构成诱发和促进肝纤维化的重要病理因素。对MMP-2的激活机制的研究很多，目前认为：MMP-2激活依赖细胞表面膜性成分，与MT1-MMP有关。首先MT1-MMP与TIMP-2形成复合物作为proMMP-2的一种受体，三者形成复合体，游离的MT1-MMP裂解proMMP-2，导致proMMP-2前肽区水解，形成MMP-2。但详细的机制至今尚未明了。尤其对HSC产生的proMMP-2的活化机理未见报道。本研究首次采用不同细胞外基质成分Ⅰ型和Ⅳ型胶原作为培养基，建立研究细胞外基质对HSC作用的实验模型，模拟活体状态，培养鼠HSC。采用凝胶酶谱方法，观察不同培养基上清液中Ⅳ型胶原酶（MMP-2、MMP-9）的前体及活化形式，收集细胞HSC，使用Western blot、RT-PCR方法，检测MT1-MMP蛋白水平表达以及MMP-2mRNA、MT1-MMP mRNA、TIMP-2mRNA的表达；目的是观察不同细胞外基质环境对HSC合成分泌MMP-2、MMP-9的影响，研究ECM成分对HSC的生物学功能的诱导作用；对MMP-2活化机制，以及MT1-MMP、TIMP-2在proMMP-2的激活过程的作用，进行深入细致的研究；探讨HSC细胞外基质重构的分子生物学机理，寻找可能改变HSC活化和MMP-2表达间互为因果的关系，为临床上阻滞或延缓肝纤维化的发展提供实验依据。 实验材料和方法 1．鼠HSC分离和培养：采用胶原震荡法进行分离鼠肝脏星状细胞。密度梯度离心，加人DMEM并补充10％的小牛血清和抗菌素，在37℃，5％CO。条件下培养。1：3分配传代培养，5刁0代细胞待用。 2．制作四种不同细胞外基质成分的培养基。聚苯乙烯培养基（POXI型胶原包被的培养基＊．C入I型胶原凝胶培养基＊．G．）．含有IV型胶原成分的Matrigel培养基（M．G．人 3．鼠HSC的无血清培养：先将鼠HSC在含有10％小牛血清的DMEM的四种培养基中培养3天后，弃上清，使用PBS缓冲液洗涤3次。为了避免小牛血清自身分泌MMP－2、MMP—9酶的前体所致的干扰，将HSC换成无血清培养，细胞洗涤后加人无血清的DMEM，再培养24小时后，收集培养上清液，通过10，000rpm，离心smin，待用。 4．凝胶酶谱KymograPhy）方法：收集无血清培养HSC培养上清，使用凝胶酶谱方法测定培养上清液中的MMP－2、MMP－9前体和活化形式。 5．Western blot方法：在上述四种培养基培养 HSC 48 ／J’时后，收集不同培养基中 HSC，提取蛋白，进行蛋白定量后，使用Western blot检测不同培养基中HSC MT；－MMP蛋白表达。 6．RT—PCR方法：在上述四种培养基培养 HSC 48小时后，收集培养基中HSC，采用RT－PCR同时检测细胞中MMP－ZmRNA、MT；－MMA。TIMP－ZmRNA水平的表达。并使用p－actin作为内对照。 7．所有 RT－PCR产物用 1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果采用 NIH Im－age计算机软件自动分析系统进行半定量分析。将四种不同培养基HSC细胞MMP－ZmRNA、MTl－MMPmRNA、TIMP－ZmRNA的泳带灰度的相对值比较，进行t检验。 实验结果： l．HSC在上述四种培养基中培养后，proMMP－2可见于任何一种培养基。MMP－2只见于 1型胶原凝胶培养基中。在上述四种培养基中均未见到ProMMP－9和MMP－9。表明作为主要细胞外基质成分的三维结构 ·2·的1型胶原可以诱导HSC大量分泌ProMMP－2并在细胞外转化为MMP一人而 HSC在含IV型胶原培养基上培养后，ProMMP－2活性化受到抑制，因而未见到活性化的MMP－2。 2．MT；－MMP蛋白水平表达：’yestern blot实验结果：四种不同条件培养的HSC，其蛋白水平表达MT；－MMP模式不同，在聚苯乙烯培养基、I型胶原包被培养基J型胶原凝胶培养基中均有表达，但是只有在1型胶原凝胶培养基表达明显增强河＜O．OU。在含w型胶原培养基中未见表达。 3．HSC在上述四种培养基中培养后，MMP－ZmRNA均可见表达，在1型胶原凝胶培养基中可见 MMP－ZmRNA表达明显增强。含 IV型胶原培养基中 MMP－ZmRNA表达明显减弱。 4．MT；－MMPmRNA表达：HSC在上述四种培养基中培养后，均见表达，只有在1型胶原凝胶培养基表达明显增强沙＜0．01人 5．TIMP－ZmRNA表达：HSC在上述四种培养基中培养后，均可见表