免疫增强剂可增强或调节机体的免疫能力,在动物临床实践中常与各类疫苗配合使用,提高免疫效果,增强机体抵抗力,防止或改善免疫抑制,对传染性疾病的防控有着积极的作用。许多药理和临床研究表明,多数中药均具有免疫促进作用,作为其活性成分之一的多糖,在免疫增强剂的研究和应用方面,已引起了养殖业的高度重视。本研究以桔梗多糖为研究对象,进行提取、分离纯化,结构分析,并通过体外活性追踪,筛选出桔梗多糖免疫增强活性的最强部位,为研制新型免疫增强剂提供理论依据。本研究首先用一步醇沉和分步醇沉法提取桔梗总多糖和2个分级多糖,分离纯化后对各多糖进行结构分析;然后从它们对鸡腹腔巨噬细胞的增殖、吞噬、细胞因子和NO释放及细胞表面共刺激分子表达的影响,比较了3个桔梗多糖的免疫增强活性,筛选出效果最好的活性部位。采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗的桔梗总多糖（PGPStc）和2个分级桔梗多糖PGPS₆₀c和PGPS₈₀c。然后过阴离子交换剂DEAE sephadex A-25柱层析,得到纯化的桔梗多糖(PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt),分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法测定各多糖的糖含量和蛋白含量,采用红外光谱法（FT-IR）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、凝胶渗透色谱（GPC）和核磁共振波谱法（NMR）等方法分析各多糖结构。结果表明,PGPS₆₀提取率最高达4.331%,PGPSt的糖含量最高达89.96%,各多糖的蛋白含量都较低。红外光谱图显示,桔梗的3个多糖均具有多糖的典型特征吸收峰;分子量分布显示,3个多糖均有两个不同的保留时间,这说明存在两个对称的窄峰,表明分子量均一性和生成的多糖纯度较高。PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt的重均分子量分别为4.14×103¹.01×105Da,5.69×103¹.12×105Da和2.05×103².67×105Da;单糖组成分析发现,PGPS₈₀主要由葡萄糖（54.322%）、阿拉伯糖（16.801%）、半乳糖（15.013%）组成,PGPS₆₀主要由葡萄糖（62.603%）、阿拉伯糖（13.925%）组成。PGPSt主要由葡萄糖（55.397%）、甘露糖（22.305%）组成;1H-NMR和13C-NMR图谱显示,PGPS₈₀和PGPSt主链均由（1→3）-β-D-Glcp-（1→6）-β-D-Glcp连接,与单糖组成分析结果一致。将PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt加入到鸡腹腔巨噬细胞培养体系中,用MTT法测定其安全浓度;然后将安全浓度下的3个多糖加入到鸡腹腔巨噬细胞中,培养4h后加入LPS,继续培养44 h后,MTT法测定鸡腹腔巨噬细胞增殖变化（最高细胞增殖率）。结果表明,PGPSt在15.625μg mL-1时的细胞增殖率最高,为132%;其次为PGPS₈₀和PGPS₆₀在15.625μg mL-1时的细胞增殖率分别为128%、117%。采用鸡腹腔巨噬细胞吞噬FITC标记的大肠杆菌的方法,检测鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性。将不同浓度的PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt加入鸡腹腔巨噬细胞中,培养4h后,加入LPS,继续培养24 h后,加入FITC-E.coli,Triton X-100避光孵育2 h。用细胞刮刀刮下,PBS洗涤后重悬细胞,用流式细胞仪检测吞噬率。结果表明,PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt均可促进巨噬细胞对FITC标记的E.coli的吞噬能力。在浓度为15.625μg mL-1时,PGPSt可明显增强巨噬细胞的吞噬率,达到23.04%,其次为PGPS₈₀（19.60%）,PGPS₆₀（16.96%）。Griess法检测NO释放。将不同浓度的PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt加入鸡腹腔巨噬细胞中,培养4h后,加入LPS,继续培养24 h后,按照NO检测试剂盒的说明书操作,在酶联免疫仪上检测540 nm处的OD值。结果表明,PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt在浓度为7.813³1.25μg mL-1时,NO的释放量均明显高于空白对照组,尤其在15.625μg mL-1时,释放量最为显著。将不同浓度的PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt加入鸡腹腔巨噬细胞中,培养4 h后,加入LPS,继续培养24 h后,按照ELISA检测试剂盒的说明书操作,在酶联免疫仪上检测450 nm处的OD值。结果表明,在浓度为31.25μg mL-1时,PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt组的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6β分泌均显著升高。将不同浓度的PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt加入鸡腹腔巨噬细胞中,培养4 h后,加入LPS,继续培养24 h后,细胞刮刀刮下,用含鸡血清的PBS染色缓冲液冲洗后,室温封闭;加入10μL CD80-FITC（或CD86-FITC）后重悬细胞,用流式细胞仪检测相对荧光强度。结果表明,PGPS₈₀,PGPS₆₀和PGPSt组显著提高细胞表面分子CD80和CD86的表达水平,浓度在15.625μg m L-1时,PGPSt的CD80和CD86的表达最为显著,分别增加了3.89倍和3.31倍。综合比较发现,PGPSt在浓度为15.625μg mL-1时,能够有效激活鸡腹腔巨噬细胞,而其免疫活性与其特殊的多糖结构密切相关。