研究背景：　　红细胞在体外储存过程中发生一系列生理生化、形态结构和功能变化，称为“储存损伤”。因此，红细胞氧亲和性的降低，流变学及粘连性的改变会加重局部缺血。一氧化氮（NO）具有强大的松弛血管平滑肌的作用，能扩张微小血管，提高红细胞通过能力和携氧能力。研究表明红细胞储存损伤与NO含量快速下降有关。有人将NO供体、NO抑制剂等加入红细胞中孵育，发现NO供体能使红细胞变形性增加，而NO抑制剂作用相反。NO可穿过细胞膜与Hb结合形成S-亚硝基血红蛋白（SNO-Hb），与输送氧和血管舒缩功能有关。血液离体后，SNO-Hb含量就开始快速持续减少。有人把红细胞直接暴露在饱和NO液体中，发现红细胞内SNO-Hb产生量显著增多。　　微小核糖核酸(miRNA)是一类非编码内源性小单链 RNAs分子，参与细胞凋亡、分化和增殖等生命过程。初步研究发现红细胞内 miRNA在储存过程中出现明显变化趋势，有可能成为“储存损伤”的生物标志物。而人为添加NO供体，有可能改善储存红细胞中NO水平，影响miRNA表达，延长红细胞储存时间、提高储存红细胞携氧能力。　　目的：　　研究储存红细胞内NO水平与miRNA表达变化，探索减轻红细胞体外低温保存损伤的可能途径与机制。　　方法：　　1)红细胞内NO浓度检测：血样采自10名健康献血者，制成悬浮红细胞，分为新鲜红细胞组和储存红细胞组。新鲜红细胞组滤除白细胞后检测红细胞内总NO、胞浆NO浓度，Hb结合NO浓度等于前者减去后者。储存红细胞组储存20天时滤除白细胞，分为两部分，一部分与终浓度分别为1、10μM SNP孵育，用全自动血液流变仪检测流变学各项指标；另一部分与终浓度分别为0.2、1、5、25μM SNP孵育，检测红细胞内三种NO含量；根据上述结果并结合文献确定合适的SNP添加浓度，为后续实验作准备。　　2) MicroRNA表达芯片及差异基因的筛选：送检新鲜悬浮红细胞组、储存20天悬浮红细胞组和储存20天悬浮红细胞添加SNP组去芯片公司进行基因芯片检测，根据差异倍数≥2和P≤0.05两个条件筛选出差异基因，并从中筛选出有意义的microRNAs作RT-qPCR验证。　　3)通过预测软件对目的miRNA进行靶基因预测，筛选出与细胞凋亡、细胞衰老、红细胞膜和NO代谢相关的mRNAs作RT-qPCR验证。　　4)分析miRNA-mRNA可能的靶向调控关系。　　结果：　　1)流变学检测结果：储存红细胞与新鲜全血参考值比较，中切（高切）还原粘度、聚集指数、刚性指数、变形指数、电泳指数均在新鲜全血参考值范围内，其余大部分流变学指标均比新鲜全血低。储存红细胞添加1μM SNP时，各项流变学指标与未加SNP组相比均无统计学差异（P＞0.05）；当增加至10μM SNP时，红细胞低切粘度、还原低切粘度、中切粘度、还原中切粘度、聚集指数和电泳指数均显著低于未加SNP组（P＜0.05），变形指数和刚性指数无统计学差异（P＞0.05）。　　2) NO检测结果：储存红细胞内总NO、胞浆NO和Hb结合NO（主要是SNO-Hb）含量比新鲜红细胞内三种NO含量下降了56.70％、59.03%和55.55%（P＜0.05）。当储存红细胞添加0.2μM SNP时，三种NO含量与未加SNP组相比均无统计学差异（P＞0.05）；当SNP浓度增加至1μM时，红细胞内三种 NO含量与未加SNP组相比分别增加了32.92%、20.28%、64.76%（P＜0.05），Hb结合NO浓度甚至接近新鲜红细胞水平（P＞0.05）；当增加至5μM甚至25μM时，总 NO和Hb结合 NO含量均明显高于未加 SNP组（P＜0.05），Hb结合NO含量甚至接近新鲜红细胞水平（P＞0.05）。　　3)芯片结果：储存组与新鲜组比较，发现109个上调基因和102个下调基因；SNP组与储存组比较，发现69个上调基因和52个下调基因。从上调和下调前10位基因中发现了两个主要的变化趋势：储存组与新鲜组比较时，miR-203a、miR-654-3p、miR-31-5p和miR-769-3p表达上升； SNP组与储存组比较时表达下降；miR-5692c、miR-145-3p、miR-3129-5p和miR-3591-5p的变化趋势正好相反。　　4) miRNA RT-qPCR验证结果：与新鲜组相比，储存组 miR-31-5p、miR-196a-5p、miR-203a、miR-654-3p、miR-3591-5p和miR-769-3p表达升高（P＜0.05），let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p表达下降（P＜0.05），miR-145-3p、miR-3129-5p和miR-5692c在各组红细胞中无表达； SNP组与储存组相比，前面10个miRNAs表达均无统计学差异（P＞0.05），miR-145-3p、miR-3129-5p和miR-5692c无表达。　　5) mRNAs RT-qPCR验证结果：储存组与新鲜组相比，BTG2和TRADD表达上升（P＜0.05），RICTOR、ATM、CASP10、CASP8、IL3、BIRC6、PPP3CA、MAP3K14和EPB41L4B表达下调（P＜0.05）；其中，BIRC6、RICTOR、CASP8、CASP10、BTG2、IL3、ATM和PPP3CA与凋亡相关；MAP3K14和ATM与衰老相关；EPB41L4B与红细胞膜相关；PPP3CA与NO信号通路相关。SNP组与储存组相比，所有验证的mRNAs表达均无显著改变（P＞0.05）。　　结论：　　1.1μM SNP对储存20天悬浮红细胞流变学改善作用不明显，10μM SNP可以明显改善储存红细胞聚集性，但对红细胞变形性改善作用不明显。　　2.红细胞储存20天后红细胞内总NO、胞浆NO和Hb结合NO（主要是SNO-Hb）含量明显降低。添加1μM SNP可以明显增加红细胞内三种NO含量，SNO-Hb甚至接近新鲜悬浮红细胞水平。　　3.红细胞储存20天后，在microRNA水平上，miR-31-5p、miR-196a-5p、miR-203a、miR-654-3p，miR-3591-5p和miR-769-3p表达升高，let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p表达下降，miR-145-3p、miR-3129-5p和miR-5692c无表达；在mRNA水平上，BTG2和TRADD表达升高，RICTOR、ATM、CASP10、CASP、IL3、BIRC6、PPP3CA、MAP3K14和EPB41L4B表达下降，它们涉及凋亡、衰老、NO等信号通路。　　4.根据靶基因软件预测及RT-qPCR验证，得出miRNA-mRNA可能的相互调节关系如下：miR-31-5p的靶基因分别是 CASP10、PPP3CA、MAP3K14和EPB41L4B；miR-203a的靶基因分别是CASP10、CASP8、IL3、ATM、PPP3CA、BIRC6、RICTOR和EPB41L4B；miR-654-3p的靶基因分别是CASP10、ATM、PPP3CA、BIRC6和RICTOR；miR-196a-5p的靶基因分别是CASP8、BIRC6、RICTOR和EPB41L4B；miR-3591-5p的靶基因分别是ATM和PPP3CA；let-7a-3p的靶基因是BTG2，进一步验证应在蛋白水平上进行。　　5.1μM SNP与储存20天悬浮红细胞孵育1h，对microRNA和mRNA水平上无显著影响。