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背景:课题组前期研究发现miR-206和miR-613可通过靶向结合于OATP1B1mRNA 3’-UTR从而抑制OATP1B1蛋白的表达。资料报道PXR、CAR、FXR、LXRα等核受体可介导OATP1B1的转录调控。采用miRWalk等生物信息学软件预测并筛选出靶向LXRα和OATP1B1 mRNA 3′-UTR的miRNAs,结果显示miR-1-3p/206/613与LXRα和OATP1B1 mRNA 3’-UTR高度互补。那么miR-1-3p/206/613是否能通过靶向LXRαmRNA 3’-UTR调控OATP1B1的表达确实值得思量;拟或对OATP1B1 mRNA 3’-UTR可呈现直接作用亦令我们关注;故而系统研究miR-1-3p/206/613对LXRα调控OATP1B1作用的影响,深入探讨其作用机制可为调控药物转运体OATP1B1的研究增添新内容。目的:1.研究核受体LXRα对转运体OATP1B1的转录调控的影响及其机制。2.研究miR-1-3p/206/613对LXRα、OATP1B1基因和蛋白表达的影响以及对OATP1B1转运功能的影响,并深入探索上述影响的分子机制。方法:1.应用生物信息学数据库miRWalk、TargetScan、miRanda,预测可靶向作用于PXR、CAR、FXR、LXRα和OATP1B1 m RNA 3’-UTR的miRNAs。2.构建h LXRα真核表达质粒(pTracer-hLXRα)、OATP1B1启动子报告质粒(pGL3-OATP1B1),双荧光素酶报告法考察LXRα对pGL3-OATP1B1荧光素酶活性的影响,探明LXRα调控OATP1B1的作用机制。3.以瞬时转染miR-1-3p、miR-206、mi R-613拟似物(mimic)或抑制物(inhibitor)的方法构建miR-1-3p/206/613过表达或抑制表达的HepG2细胞模型,运用RT-qPCR方法验证模型是否构建成功。4.运用RT-qPCR法检测HepG2细胞中LXRα和OATP1B1 mRNA的表达水平,运用Western blotting法检测HepG2细胞中LXRα和OATP1B1蛋白水平,探究miR-1-3p/206/613对HepG2细胞LXRα和OATP1B1表达的影响。5.LC-MS/MS方法检测HepG2细胞中瑞舒伐他汀的含量,探明miR-1-3p/206/613对OATP1B1转运瑞舒伐他汀能力的影响。6.构建LXRαmRNA 3’-UTR野生型报告质粒(pGL/LXRα-WT)和miR-1-3p/206/613结合位点突变的突变型报告质粒(pGL/LXRα-Mut),双荧光素酶报告基因法考察结合位点突变前后miR-1-3p/206/613对报告质粒荧光素酶活性的影响,探明miR-1-3p/206/613作用于LXRαmRNA 3’-UTR的确切位点;同上,探明miR-1-3p/206/613作用于OATP1B1 mRNA 3’-UTR的确切位点;以此阐明miR-1-3p/206/613调控LXRα和OATP1B1表达的分子机制。7.数据处理与统计分析:实验所得数据以均数±标准差(mean±SD)表示,应用Graphpad Prisms 5.0、Microsoft Excel及Image J等软件作图,SPSS23.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验(Student’s t-test)、多组间采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05表示组间差异有统计学意义。结果:1.miRWalk、TargetScan、miRanda生物信息学数据库均预测到miR-1-3p/206/613与LXRα和OATP1B1 mRNA 3’-UTR互补配对结合,且具有较高的特异性、保守性及结合稳定性。2.实验组的相对荧光素酶活性约是对照组的2.6倍。3.miR-1-3p、miR-206、miR-613拟似物(mimic)各组miRNA表达水平明显上调,分别是对照组的1069.04、1228.99和1157.48倍;miR-1-3p、mi R-206、miR-613抑制物(inhibitor)各组miRNA表达水平明显抑制,分别是对照组的0.31、0.28和0.28倍;差异均有统计学意义(P<0.05)。表明miR-1-3p/206/613过表达或抑制表达的HepG2细胞模型构建成功。4.结果显示miR-1-3p/206/613 mimics各组LXRαmRNA水平明显下调,分别为对照组的0.40、0.45和0.51倍;miR-1-3p/206/613 inhibitors各组LXRαmRNA表达水平明显上调,分别为对照组的5.26、4.51、3.97倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-1-3p/206/613 mimics各组OATP1B1 mRNA水平分别为control组的1.04倍、1.10倍和1.03倍,mi R-1-3p/206/613 inhibitors各组的OATP1B1mRNA水平分别为对照组的1.09、0.98和1.01倍,因此无论是miR-1-3p/206/613mimics还是inhibitors,各组对OATP1B1 mRNA表达均无直接调节效应,差异无统计学意义(P>0.05)。5.miR-1-3p/206/613 mimics能明显下调LXRα和OATP1B1蛋白,与对照组相比,LXRα蛋白分别下调16.5%、16.0%、25.1%,OATP1B1蛋白分别下调30.4%、30.5%、44.4%;miR-1-3p/206/613 inhibitors能明显上调LXRα和OATP1B1蛋白表达,LXRα蛋白分别上调13.3%、13.3%、16.0%,OATP1B1蛋白分别上调25.0%、25.6%、30.4%,差异均有统计学意义(p<0.05)。6.当RSV浓度为5μM时,miR-1-3p/206/613 mimics能分别下调HepG2细胞RSV的摄取量至对照组的0.50、0.19和0.30倍;浓度为60μM时,RSV的摄取量下调至对照组的0.49、0.24和0.23;浓度为125μM时,RSV的摄取量下调至对照组的0.64、0.48和0.31。与之相反,当RSV浓度为5μM时,miR-1-3p/206/613inhibitors能分别上调HepG2细胞中RSV的摄取量至对照组的的1.26、1.59和2.07倍;浓度为60μM时,RSV的摄取量上调至对照组的1.97、2.44和2.63倍;浓度为125μM时,RSV的摄取量上调至对照组的2.22、2.86和2.93倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.miR-1-3p/206/613 mimics可显著抑制pGL/LXRα-WT报告基因荧光素酶活性,与对照组相比荧光素酶活性分别下降38.5%、32.5%和32.8%;mi R-1-3p/206/613 inhibitors可显著激活pGL/LXRα-WT报告基因荧光素酶活性,与对照组相比荧光素酶活性分别升高137.0%、75.8%和55.7%,差异具有统计学意义(P<0.05);而在结合位点突变的pGL/LXRα-Mut报告基因系统中,miR-1-3p/206/613 mimics或inhibitors对荧光素酶活性均无显著影响(P>0.05)。提示miR-1-3p/206/613可与LXRαmRNA 3’-UTR结合而抑制酶活性。8.同上,miR-1-3p/206/613 mimics可显著抑制pGL/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性,与对照组相比荧光素酶活性分别下降24.3%、28.9%和32.1%;miR-1-3p/206/613 inhibitors可显著激活pGL/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性,与对照组相比荧光素酶活性分别升高33.5%、48.3%和61.6%,差异具有统计学意义(P<0.05);而在结合位点突变的pGL/OATP1B1-Mut报告基因系统中,miR-1-3p/206/613 mimics或inhibitors对荧光素酶活性均无显著影响(P>0.05)。提示miR-1-3p/206/613可与OATP1B1 mRNA 3’-UTR结合而抑制酶活性。结论:1.本研究建立的过表达或抑制表达mi R-1-3p/206/613的HepG2细胞模型可重复性良好。2.核受体LXRα可参与转运体OATP1B1的转录调控。3.miR-1-3p/206/613通过直接靶向作用于OATP1B1 mRNA 3’-UTR,从而调控OATP1B1的表达和转运功能。4.miR-1-3p/206/613可通过靶向作用于LXRαmRNA 3’-UTR而间接调控OATP1B1的表达和转运功能。