论文部分内容阅读
目的:变态反应性哮喘(AA)的发病机制有待进一步研究。中性粒细胞(PMN)是AA发病的主要炎症细胞之一。这项研究旨在确定变态反应原(Ag)特异性PMN(sPMN)及其在AA发病机理中的作用;tExo外泌体的构建及其治疗AA机制的研究。方法:首先应用卵清蛋白(OVA)作为特异性Ag(sAg)和弗氏佐剂(CFA组)作为免疫增强剂建立AA小鼠模型。作为比较,用传统的方法即OVA作为sAg和氢氧化铝(Alum组)作为免疫增强剂也建立AA小鼠模型。然后进行气道高反应性(AHR),支气管肺泡灌洗液(BALF)中OVA特异性抗体(sIgE、sIgG)、PMN及其炎性介质中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、嗜酸性粒细胞(Eos)及其炎性介质碱性蛋白酶(MBP)和过氧化物酶(EPX)、巨噬细胞(Mφ),血清中sIgE、sIgG、辅助性T淋巴细胞1(Th1)炎性介质干扰素γ(IFN-y)、辅助性T淋巴细胞2(Th2)炎性介质(白介素4、5、13即IL4、IL5、IL13)、气道上皮屏障通透性等酶联免疫吸附测定(ELISA),肺组织炎症评分及与肺组织炎症评分的相关性分析;经流式细胞术(FCM)检测Eos/PMN/Mφ等免疫细胞的比例、活化;同时蛋白质免疫印迹(WESTERN BLOT)和免疫沉淀(IP)检测sIgG与CD64(即Fc段γ受体I,FcyRI)表达,以探讨PMN在AA中特性分析及其作用机制的研究。收集骨髓来源树突状细胞(BMDC),构建携带有αCD64/OVA融合蛋白的tExo外泌体,然后建立OVA/CFA致敏AA小鼠模型并用携带有αCD64/OVA融合蛋白的tExo外泌体进行滴鼻治疗,经AHR、肺组织炎症评分、ELISA和FCM等技术检测AHR、小鼠肺组织炎症、BALF中NE/TNF-α/sIgE/sIgG/IL-4/IL-5/IL-13和IFN-γ的表达水平及BALF中PMNs/Eos/Mφ的比例,以探讨tExo治疗AA的疗效及机制。结果:OVA/CFA致敏AA小鼠中PMN的比例及其炎症介质NE、TNF-α与肺组织炎症评分呈正相关性;AA小鼠含有少量sPMN,这些sPMN暴露于sAg时被激活;sPMN表达更高水平的FcγRI,与sIgG结合形成复合物,携带sIgG/FcγRI复合物的PMN通过暴露于sAg来激活,这些PMN可以指定为sPMN。为了通过耗尽sPMN来治疗AA,本研究构建了携带有αCD64/OVA融合蛋白的tExo外泌体。tExo治疗AA小鼠后可显著降低小鼠的AHR,也显著降低 BALF中NE、TNF-α、sIgE、sIgG、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的表达及降低BALF中PMNs、Eos的比例,且明显改善小鼠肺组织炎症;其治疗机制可能是通过特异性识别sPMN,并诱导sPMN凋亡以减少sPMN分泌的NE和TNF-α等炎性细胞因子表达,抑制AA小鼠肺组织炎症,同时tExo治疗不会影响其他PMN,也不会影响人体的防御系统。结论:PMN在OVA/CFA致敏哮喘小鼠中起到重要作用。在小鼠的气道中鉴定出了一部分sPMNosPMN可以在暴露于sAg后被激活从而诱导或加重AA。tExo可诱导sPMN凋亡,抑制AA,具有很好的AA治疗潜力。研究结果为PMN浸润为主的AA等变态反应性疾病的治疗提供一种新技术和新方法。