随着人类基因组草图的绘制完成,使得探索各种生命现象的遗传本质研究成为可能。对基因功能、表达调控、多个基因间以及基因和环境间相互作用等方面的研究有助于弄清生物体是如何运作的以及生物体与环境的相互作用。然而如何解码人类的基因组,使其能够成为人类各种生命活动情况的指标,是科研的重大课题。对基因组序列中单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP)的研究是该阶段的重要研究内容之一。SNP作为第三代遗传标记,具有数量多、密度大、分布广等特点,可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等,并在疾病的早期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。 快速、准确、低价的获取大量SNP分型信息是进行SNP相关研究的前提。对SNP检测有基于不同技术的很多方法,它们各有利弊,然而还没有一种方法能够完全的满足需要。DNA微阵列由于其平行性、高通量检测等特点,在SNP分型上有很大的优势,但是现行的基于DNA微阵列的办法无外两种：一是同时对多个样本的同一个SNP位点做检测,二是对一个样本的多个位点做检测。面对大量样本的多个SNP检测,这两种办法都存在局限性,急迫的是建立一种多位点的SNP检测方法,以满足对基因组上多个SNP位点的同时检测。本文提出了一种基于聚丙烯酰胺凝胶的多位点SNP检测芯片分型技术,并将其应用于孤独症易感基因的研究中,主要内容如下： 1.基于聚丙烯酰胺凝胶的多位点SNP检测芯片的制备 由东南大学生物电子学国家重点实验室提出的基于聚丙烯酰胺凝胶的SNP检测平台,是一种准确性高、通量高、步骤简单且易于控制的SNP检测技术。将多重PCR技术与三维凝胶芯片的平台相结合。通过多重PCR可以把多位点引入基于聚丙烯酰胺凝胶的SNP检测平台,在一张DNA芯片中同定上大量样本的多个SNP位点的信息,实现多位点检测,从而大人提高检测的效率。 2.基于多位点大样本的SNP检测芯片应用于孤独症易感基因的研究 利用生物信息学筛选并结合现有文献的报道,选择了位于4p12上的GABRA4基因的5个SNPs。应用多位点SNP检测芯片,我们对128个孤独症家系和120例年龄和性别匹配的正常对照的SNP分型,对这5个SNP位点和由其组成的单倍型域(haplotype block)进行易感基因的相关性分析,采用基于病例的ease-control方法和基于家系的传递不平衡检验(Transmission/Disequilibrium Test,TDT)进行统计和遗传学分析以及单倍型分析(haplotypeanalysis)。结果显示：8种SNP组合的单倍型在孤独谱系障碍(Autistic Spectrum Disorders,ASD)家系中传递是不平衡的,分别为rsl912960-rS17599165(p=0,008878),rs2280073-rs17599165(p=0.03824),rs1912960-RS2280073-rs17599165(p=0.01449),rs1912960-rs17599165-rs17599416(p=0.0331),rs1912960-rs17599165-rs7660336(p=0.01354),rs1912960-rs2280073-fs17599165-rs17599416(p=0.04783),rs1912960-rs2280073-rs17599165-rs7660336(p=0.02002)和rs1912960-rs2280073-rs17599165-rs17599416-rs7660336(p=0.03106),说明这些单倍型在ASD家系中的传递与ASD相关。 将128个受累样本根据临床资料进行分组,发现在儿童孤独症评定量表(Child AutismRating Scale,CARS)得分小于等于30的病例组中,发现有3个位点的等位基因与ASD显著相关,分别是rs1912960(p=0.043),rs2280073(p=0.028),rs17599416(p=0.017);并且rs2280073(p=0.030)的基因型在这个组中也与ASD相关联,提示在此区域附近可能存在造成这类病人患病的易感基因。 在病例组内进行对照分析,表明rs17599165和rs17599416这两个位点与ASD的CARS得分相关。 可以得出结论GABRA4基因在某些方面与汉族人群的孤独症相关。同时我们的实验结果也进一步表明多位点高通量SNP检测技术具有效率高、灵敏度高、成本低、准确性、稳定性和重复性好等特点,在临床检测中具有极大的应用前景。