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目的:肝细胞癌（HCC）是临床常见的实体瘤之一,在全球最常见癌症中致死率排名第三,是一种严重危害人类健康的重大疾病。目前治疗HCC的方法有限,仅部分患者在发病时可行手术治疗,且复发转移率超过60%,治疗效果欠佳;FDA批准的晚期肝癌治疗药物多靶向小分子激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）仅能延长寿命2-3个月,且易出现不良事件。因此,研究HCC发生的分子机制,探讨其新的治疗方法就显得尤为重要和迫切。原癌基因突变或异常表达引起细胞信号通路失控,从而介导细胞异常增殖或抑制细胞程序性死亡,最终形成HCC,是肝细胞癌变的主要机制之一。研究表明,原癌基因AKT与c-Met过表达或异常激活是HCC发生发展过程中的高频事件,针对AKT或c-Met介导HCC发生发展的作用机制已有报道。然而,AKT与c-Met在肝癌发形成中的协同作用及分子机制,至今仍不十分清楚。雷公藤红素（Celastrol,又名南蛇藤素）是从中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）等卫矛科植物中的单体化合物,对结肠癌、肺癌、肝癌、白血病、胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞均有抗肿瘤作用。现有雷公藤红素抗肝癌作用研究中,无论是模型运用还是研究方法手段均存在一定局限性,雷公藤红素对HCC发生发展中环节的调控作用至今未见报道;同时,雷公藤红素水溶性差,口服生物利用度低,因而限制了其作为药物的开发应用。本课题首先运用分子生物学方法研究AKT/c-Met在肝癌形成中的协同作用及分子机制;基于以上AKT/c-Met诱导的HCC模型,阐明雷公藤红素治疗HCC的分子机制;运用现代药剂学技术制备一种稳定、具备长循环能力的雷公红素脂质体。本研究为HCC的发生机制和治疗方法提供新的研究方向和依据。方法:1.利用SB介导的高压尾静脉转染技术,在野生型（WT）FVB/N小鼠肝脏中过表达AKT的激活形式myr-AKT1（带有HA-Tag）和/或激活的c-Met（带有V5-Tag）,定期对小鼠进行肿瘤大体形态检测;当小鼠肿瘤负荷过大时,处死濒死小鼠,分离肝脏后进行病理学和肝癌特异性标志物检测,确认肿瘤类型和特征。2.（1）采用Western bloting法检测WT、AKT、c-Met和AKT/c-Met（同时过表达AKT和c-Met）小鼠肝中AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白的的表达情况。（2）应用shRNA技术,在小鼠体内沉默mTORC1特异性复合体Raptor的同时过表达AKT/c-Met,观察肝脏肿瘤的形成情况。（3）利用脂肪酸合成酶FASN转基因小鼠(FASNfl/fl小鼠),通过Cre重组酶和AlbCre小鼠杂交技术分别使脂质生物合成的主要成员FASN敲除,观察AKT/c-Met共表达诱导小鼠肝癌的形成情况。（4）筛选磷酸化/激活AKT和c-Met蛋白高表达的HCC细胞系,单独或联合运用AKT抑制剂MK2206、c-Met抑制剂EMD1214063,观察AKT和c-Met抑制剂对HCC细胞系增殖和凋亡的影响,并检测相关蛋白的表达水平。3.通过免疫组化法检测FASN、磷酸化/激活的AKT（p-AKT473）和c-Met在94例人体HCC标本中的表达情况,并分析三者在HCC中的相关性。4.运用以上高压尾静脉转染AKT/c-Met诱导的HCC小鼠模型,以HCC治疗药物Sorafenib为对照药物,研究雷公藤红素对AKT/c-Met诱导小鼠肝癌肝脏外观和重量、病理组织学和肝癌标志物的影响;采用免疫组化与Western bloting法,检测雷公藤红素对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝癌组织中增殖相关蛋白、AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响。5.采用薄膜分散法,以荷载雷公藤红素脂质体的包封率和粒径为评价指标,考察不同超声条件、药脂比、磷胆比对雷公藤红素脂质体制备工艺的影响;按照雷公藤红素脂质体的最优工艺,考察PEG-DSPE用量对雷公藤红素长循环脂质体制备工艺的影响;进行雷公藤红素长循环脂质形态学、贮存稳定性与冻干工艺考察;考察游离雷公藤红素、雷公藤红素脂质体和雷公藤红素长循环脂质体的体外释放行为、在HepG2细胞中摄取动力学和毒性作用。结果:1.FVB/N小鼠肝脏中过表达AKT 8周后可以诱导肝脂肪变性和增殖,但无肝脏肿瘤形成;当AKT转染24周后可以导致肝细胞癌的形成;c-Met在转染12周后小鼠肝脏未见异常,但长时间的过表达最终会导致非典型增生病灶形成;而AKT/c-Met共表达可在转染6-8周后快速形成致命的肝脏肿瘤负荷,所形成的肿瘤符合肝细胞癌的病理学和肝癌特征。2.（1）AKT/c-Met共表达诱导的HCC小鼠肝脏组织中AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路被激活。（2）沉默Raptor基因可抑制AKT/c-Met共表达诱导的小鼠HCC形成。（3）敲除FASN基因可抑制AKT/c-Met共表达诱导的小鼠HCC形成。（4）MK2206和EMD1214063均能抑制HLE和HLF细胞的增殖,并促进其细胞凋亡,且MK2206和EMD1214063联合给药时,对抑制肝癌细胞的增殖和促进细胞凋亡具有协同效应。3.与正常肝组织相比,FASN、p-AKT（473）和c-Met蛋白表达量分别在90.4%、59.6%、28.7%的临床HCC样本中发生上调;在所有高表达p-AKT和c-Met的HCC组织中,FASN的蛋白表达量均出现上调;88.9%（27例中有24例）高表达c-Met的肝癌标本中p-AKT也具有高表达量。4.雷公藤红素（1或2mg/kg）给药后,AKT/c-Met共表达诱导的小鼠HCC肝脏重量和肝脏指数显著降低,肝脏外观较规则;病理组织学研究发现雷公藤红素治疗的HCC小鼠肝脏细胞异型性明显减轻,肝细胞内充满胞浆,空泡变性明显减轻,细胞核变小,多核细胞明显减少,部分肝小叶结构相对较好;雷公藤红素治疗的HCC小鼠血清中AFP和肝脏中AFP、GPC3、Epcam的表达水平显著减低;Sorafenib给药组和AKT/c-Met模型组小鼠相比,肝脏外观形态、肝脏重量、HE病理组织学及Ki67表达情况均相近;雷公藤红素治疗的HCC小鼠肝组织中Ki67、PCNA表达水平明显降低,并呈现剂量-效应关系;雷公藤红素治疗的HCC小鼠肝组织中AKT/mTOR（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、p-4EBP1、PKM2、FASN）和Ras/MAPK（p-ERK1/2）信号通路蛋白表达量降低。5.确定了雷公藤红素脂质体最佳制备工艺,得到脂质体的粒径、PDI和包封率分别为95.5±1.8 nm、0.236±0.021、92.8±1.5%;确定了雷公藤红素长循环脂质体最佳制备工艺,得到长循环脂质体的粒径、PDI和包封率分别为143.2.7±2.4 nm、0.259±0.008、97.3±1.4,并且其呈球形、形态较均一、分散较好,能在4oC保存20天;游离雷公藤红素、雷公藤红素脂质体和雷公藤红素长循环脂质体,在36h时的体外总释放量分别为68%、30.8%、27.4%,在4h时的细胞摄取量分别为6.51%、27.61%、34.53%,在HepG2细胞中24 h时的IC50分别为2.52μg/mL、1.59μg/mL、0.83μg/mL。结论:AKT/c-Met共表达诱导HCC的快速形成与AKT/mTORC1/FASN和Ras/MAPK信号通路活化相关;FASN、p-AKT和c-Met共表达在肝癌的发生中发生率较高,是人类HCC的恶性生物学特征;同时抑制AKT和c-Met磷酸化过程可作为AKT/mTOR和c-Met异常激活的肝癌的有效治疗策略;雷公藤红素可以对AKT/c-Met肝癌小鼠AKT/mTORC1/FASN通路和ERK1/2的磷酸化产生双重抑制作用,使肝癌细胞异常增殖受阻发挥抗HCC作用;用PEG-DSPE修饰后的雷公藤红素长循环脂质体粒径小于200nm,包封率高、稳定、形态均一、分散好,在体外可以持续缓慢释放药物,细胞摄取量增加和毒性增强,可能成为一种有效治疗肿瘤的雷公藤红素新剂型。