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第一章褪黑素对人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育的作用研究研究目的:卵母细胞成熟是卵子质量的重要决定因素,获得充分成熟的卵母细胞是生殖过程的核心环节。卵母细胞成熟不充分能够导致卵子质量差,受精失败,不正常的受精和非整倍体胚胎等。低质量的胚胎则会招致流产,先天性异常等不利的临床结局。因此,促进卵母细胞成熟提高卵子质量不仅有利于改善辅助生殖患者的临床结局,更关系到人类出生子代的健康。目前已经报道一些激素和生长因子能够促进人类卵母细胞成熟,但是大部分报道缺乏深入的机制研究。褪黑素能够通过其经典的抗氧化功能促进非灵长类物种的卵母细胞成熟及早期胚胎发育,但褪黑素对卵母细胞成熟的其他作用途径很少受到关注。褪黑素的抗氧化作用能够帮助提高细胞膜的流动性,降低细胞膜的刚性,从而促进网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediatedendocytosis,CME)。然而,尚无研究报道褪黑素是否可以通过调节CME对卵母细胞成熟发挥作用。因此,围绕CME展开褪黑素作用于人类卵母细胞成熟的机制探索是本研究的重点。研究方法:收集临床废弃并捐赠科研的GV期卵母细胞,采用卵母细胞体外成熟培养和卵胞浆内单精子注射(ICSI)的方法研究褪黑素对人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育的促进作用。通过单颗卵母细胞透射电镜、real-time PCR、免疫荧光的方法分别在超微结构、RNA水平和蛋白水平上证实褪黑素对人卵成熟过程中CME的作用,并使用CME的抑制剂dynasore进行补充证明。为了明确褪黑素如何调节CME,首先通过real-time PCR的方法验证人卵中褪黑素膜受体的表达,然后利用免疫荧光的方法明确在H2O2存在的条件下,同时添加褪黑素与否,CME的marker蛋白表达水平的变化。利用酶联免疫吸附试验测量人卵中的cAMP水平,探讨CME调节人类卵母细胞成熟的相关机制。结果:(1)最适浓度的褪黑素(10-11 M)能够显著提高人类卵母细胞的成熟率(71.9%vs.45.9%,P=0.03),受精率(81.4%vs.61.4%,P=0.017)和囊胚形成率(32.2%vs.15.8%,P=0.039)。明确了 10-11M浓度的褪黑素可有效促进人类卵母细胞成熟和早期胚胎发育。(2)在人类卵母细胞成熟的过程中,电镜结果发现褪黑素显著增加了包被的内吞小凹(2.0倍,P=0.01)和内吞小泡(2.7倍,P=0.029)的数量。褪黑素使CME的marker基因在RNA水平大部分呈上升趋势,同时亦显著上调了 CME的marker 蛋白 clathrin(1.1 倍,P=0.015)和 AP2(1.2 倍,P=0.016)的表达水平。此外,在CME抑制剂dynasore存在的情况下,同时添加褪黑素可以挽救其对卵母细胞成熟和CME的抑制作用。证实褪黑素可增强人类卵母细胞成熟过程中的CME。(3)人类卵母细胞上没有褪黑素膜受体的表达,但是H202的存在使得卵母细胞中 CME 的 marker 蛋白 clathrin(0.6 倍,P=0.028)和 AP2(0.8 倍,P=0.018)与对照组相比显著下调;同时添加褪黑素后,marker蛋白clathrin(1.7倍,P=0.047)和AP2(1.3倍,P=0.004)的表达水平与H202组相比显著上调,并达到了与对照组相似的水平。也就是说,褪黑素可以通过其不依赖于受体的抗氧化剂和自由基清除剂效应调节CME。(4)与对照组卵母细胞中cAMP水平(3.48fmol/卵)和GVBD率(66.7%)相比,CME抑制剂dynasore组卵里的cAMP水平(4.10fmol/卵)最高,GVBD率(55.6%)最低;褪黑素组卵里的cAMP水平(3.15fmol/卵)最低,GVBD率(75.0%)最高。说明CME可以通过影响卵里的cAMP水平调节人类卵母细胞成熟。结论:褪黑素促进了人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育。机制研究表明褪黑素通过其抗氧化功能增强CME,增强的CME通过降低卵里的cAMP水平促进其成熟。本研究为褪黑素促进人类卵母细胞成熟提高卵子质量提供了强有力的科学依据。第二章生长激素对人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育的作用研究研究目的:生长激素(GH)在不孕症患者促排卵过程中体内应用能够改善卵巢功能,卵子质量以及子宫内膜的状态,从而有利于辅助生殖患者的临床结局。除了应用于患者体内,将GH添加到体外培养液中,亦有利于多种动物的卵母细胞成熟及早期胚胎发育。关于GH对人类卵母细胞成熟的作用尚没有系统性的研究。因此,本研究旨在明确GH对人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育的作用,并探讨相应的作用机制。研究方法:收集临床废弃并捐赠科研的GV期卵母细胞,采用卵母细胞体外成熟培养和ICSI的方法研究GH对人类卵母细胞成熟及早期胚胎发育的作用。通过单细胞转录组测序明确GH作用后人类卵母细胞中基因表达谱的变化,同时应用real-time PCR的方法对差异表达基因进行验证。结果:最适浓度的GH(200 ng/mL)能够显著提高人类卵母细胞的成熟率(70.0%vs.35.0%,P=0.004),并使受精率(73.1%vs.60.3%,P=0.158)和囊胚形成率(25.0%vs.15.5%,P=0.214)呈现上升的趋势。单细胞转录组测序和real-time PCR的结果显示GH显著上调了跟减数分裂进程,细胞内氧化还原稳态以及卵母细胞发育潜能相关的基因,如AURKA(aurora kinase A,2.1倍,P=0.007),PDIA6(proteindisulfideisomerasefamily Amember6,2.5 倍,P=0.007),LINGO2(leucine rich repeat and Ig domain containing 2,5.5 倍,P=0.007),和CENPJ(centromere protein J,1.9 倍,P=0.039)。结论:生长激素可能通过加速减数分裂进程,平衡氧化还原稳态,加强卵母细胞发育潜能等方面促进人类卵母细胞成熟。