目的:子痫前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病,迄今为止,其潜在的发病机制仍未完全阐明。子痫前期病理变化起始于多种因素如胎盘滋养细胞凋亡、自噬过度,侵袭能力降低,导致胎盘“浅着床”和胎盘血管重铸障碍引发PE。微小RNA(microRNA)Let-7b通过对各种细胞炎症、分化、凋亡、自噬及侵袭功能调控参与各类疾病,如炎症、成骨分化及肿瘤等的发生。我们推测Let-7b也可能参与胎盘滋养细胞凋亡、自噬、EMT及侵袭等各项功能调控参与PE发生。方法:1.Let-7b在PE胎盘及PE滋养细胞模型中的表达1.1使用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测Let-7b在PE滋养细胞模型和对照组中的表达变化。1.2 qRT-PCR检测Let-7b在21个PE和19个正常妊娠组胎盘组织中的表达变化。1.3 westernblot检测PE胎盘和PE滋养细胞模型中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)表达水平。2.Let-7b对滋养细胞生物学功能影响选择细胞滋养细胞模型HTR-8/SVneo,构建了Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照,qRT-PCR检测Let-7b表达变化。2.1使用CCK8、EdU实验来检测Let-7b对滋养细胞增殖的影响。2.2使用流式细胞术、Annexin V/DAPI染色检测Let-7b对滋养细胞凋亡情况的变化;Western blot方法检测凋亡蛋白caspase3表达变化。2.3使用Western blot法检测Let-7b对滋养细胞自噬蛋白LC3B表达变化,qRT-PCR法检测自噬相关基因Atg7、Atg4B和beclin改变。2.4使用qRT-PCR法检测Let-7b对滋养细胞TNF-α,IL-6和IL-10免疫炎性细胞因子的变化情况。2.5使用Western blot实验检测过表达Let-7b后对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transi-tion,EMT)E-cadherin和Vimentin蛋白表达变化。使用Transwell检测过表达Let-7b后对细胞侵袭能力的改变。3.Let-7b对滋养细胞EMT过程及侵袭机制的研究3.1 Let-7b对ERK通路激活/抑制的验证及与通路相关的EMT与侵袭机制选择细胞滋养细胞模型HTR-8/SVneo,构建了Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照,使用Western blot法检测过表达Let-7b后对ERK通路蛋白变化的影响。通过使用ERK信号通路抑制剂U-0126阻断过表达Let-7b组及对应阴性对照组ERK的活化,Western blot及Transwell实验检测滋养细胞EMT及侵袭功能的变化。3.2 Let-7b下游靶基因的筛选与验证通过对Targetscan,miRBase等生物信息学网站分析,挑选与所研究Let-7b具有碱基互补的TGFBR1。对Let-7b过表达的滋养细胞及对应的阴性对照分别检测TGFBR1蛋白水平变化。3.3 Let-7b通过对下游TGFBR1的调控调节ERK通路的机制研究回复实验检测Let-7b对TGFBR1的调控及Let-7b通过下游TGFBR1调控ERK通路及对滋养细胞侵袭功能的影响。结果:1.在PE滋养细胞模型中,Let-7b的表达较正常对照组明显下调。PE胎盘组织中Let-7b表达显著低于正常妊娠组。同时发现,PE滋养细胞模型和PE胎盘ERK通路蛋白的表达均明显降低。2.体外实验验证发现,Let-7b可以明显促进滋养细胞增殖、EMT过程及侵袭功能,并降低其凋亡、自噬能力。同时发现,Let-7b可降低细胞中TNF-α的表达,同时增加IL-6的产生。3.Let-7b可以激活ERK信号通路,并可以通过ERK信号通路进而促进滋养细胞的EMT及侵袭功能。通过生物信息学方法分析预测及实验验证发现,Let-7b与TGFBR1 mRNA 3’-UTR区特异性结合并且负向调控TGFBR1蛋白水平表达。内源性过表达Let-7b可激活ERK通路参与滋养细胞侵袭,并且这种激活作用是通过下游TGFBR1介导进而实现的。结论:通过研究发现,PE滋养细胞模型Let-7b表达下降,并通过调控滋养细胞EMT和侵袭功能,以及增殖、凋亡、自噬、炎症反应等过程参与PE的发病。Let-7b/TGFBR1/ERK调控通路可能参与临床PE的发生发展,为PE的治疗奠定了理论基础。