1研究背景子痫前期是妊娠期特有的累及多系统、多器官的严重并发症,临床特点为既往无高血压病史的孕妇妊娠20周后首次出现高血压(血压至少2次≥140/90mmHg)和蛋白尿(≥300mg/24小时),可伴全身多器官功能损害或功能衰竭。子痫前期按病情严重程度可分为轻度子痫前期与重度子痫前期,子痫前期一旦血压(≥160/110mmHg)和(或)尿蛋白(≥2000mg/24小时)升高明显,或出现终末器官功能障碍即可诊断重度子痫前期。重度子痫前期常出现肝肾功能异常。肝细胞功能受损可致血清ALT、AST升高,以及白蛋白缺乏为主的低蛋白血症；肾功能受损时,血清肌酐、尿素氮、尿酸升高,且血清尿酸升高可作为子痫前期病情严重程度的评估指标。子痫前期按发病时间可分为早发型子痫前期和晚发型子痫前期,以妊娠34周为分界点。早发型子痫前期发病早,病情重,再次妊娠复发风险高,且胎儿未成熟,出生后存活率低、合并症多。晚发型子痫前期母胎预后一般较好。据报道两种类型的发病机制可能存在差异。另外有学者认为子痫前期是一种临床综合征包含两种起病因素：母源性子痫前期和胎盘源性子痫前期。胎盘源性子痫前期指健康孕妇因为胎盘异常形成而发展为子痫前期,而母源性子痫前期指孕妇因为已存在的一些疾病如心血管疾病、慢性高血压或糖尿病等导致的子痫前期发生,而不存在异常胎盘形成。子痫前期发病率较高,且近年有升高的趋向,严重威胁母婴健康,目前仍无有效防治方法,一直是产科研究的热点与难点。虽然全世界每年有超过25000篇关于子痫前期的文章发表,也提出遗传易感性、免疫因素、氧化应激、胎盘缺血缺氧、营养缺乏等相关因素,但迄今为止没有一个因素可以完全解释子痫前期的临床症状和病理生理过程,且尚未找到一个研究子痫前期的理想动物模型。子痫前期的确切病因、发病机制尚未完全阐明；但既然娩出胎盘是治愈此病的唯一已知方法,胎盘毫无疑问在此病的发生发展中起关键作用。目前国内外学者多认为胎盘缺氧/缺血是子痫前期发病的关键因素。多种因素可导致胎盘缺氧,如母体缺氧、母体低血压和胎盘缺血等,但较多学者认为导致子痫前期胎盘缺氧的因素是胎盘血管形成不良。众所周知,胎盘是母亲与胎儿间物质交换的器官,正常的胎盘发育形成取决于细胞滋养细胞的适当分化和生长。在正常的胎盘形成过程中,滋养细胞中的中间型滋养细胞和血管内滋养细胞于妊娠10周开始沿螺旋小动脉逆行浸润,逐渐取代血管内皮,此生理现象被称为“血管重铸”。妊娠12周前,这种“血管重铸”仅发生于蜕膜间的螺旋小动脉；孕12-16周间,“血管重铸”可见于肌层间的螺旋小动脉。子痫前期的发生被认为是在胎盘形成过程中滋养细胞浸润过浅,“血管重铸”异常,导致胎盘血流减少,胎盘缺血、缺氧促使胎盘释放一系列因子,引起全身血管内皮损伤。因此寻找导致血管内皮损伤、血管痉挛、氧化应激发生致终末器官缺血的特异因子成为揭示子痫前期发病机制的关键。近几年一系列临床和基础研究在这方面取得了很大的突破。近几年大量文献研究的重点集中于血管内皮生长因子(VEGF)及其受体可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt1)和胎盘生长因子(PIGF)。VEGF、PIGF及sFlt1在胎盘形成、血管重铸过程中起重要调节作用,这些因子的失平衡是子痫前期发病的关键。在正常妊娠过程中,VEGF主要由胎盘产生,并维持胎盘血管的发育和功能。血管生成是胎盘形成的基本过程之一,这个过程由血管生成因子及其拮抗因素来维持平衡。在妊娠早期,胎盘VEGF和PIGF作为促进血管生成因子发挥重要作用。sFlt1是VEGF的受体之一,体外实验显示其降低滋养细胞的浸润能力。妊娠早期孕妇循环中的sFlt1处于较低水平,而在晚孕期升高明显但低于子痫前期患者。sFlt1与子痫前期有关的最早证据是发现它在子痫前期患者的羊水中表达升高,接着动物实验显示注射sFlt1的老鼠发生蛋白尿。同时临床观察发现子痫前期孕妇血清及胎盘组织sFlt1表达升高,且动物注射sFlt1后出现肾小球血管内皮增生和高血压。较多的实验也证实子痫前期孕妇血清sFlt1水平升高伴VEGF和PIGF水平下降。基于以上证据,提出了子痫前期的病理模型：生理妊娠sFlt1在早中孕期处于低水平,晚孕时不断上升；且伴随sFlt1的升高,VEGF和PIGF下降。这些因子一定比例的动态变化维持胎盘血管的正常形成；而在子痫前期患者,这些因子的正常比例被改变,抗血管生成作用大于促血管生成作用；过量的sFltl中和循环中的VEGF和PIGF,导致促血管生成因子下降,最终引起血管内皮功能障碍和子痫前期症状的发生。由于伦理限制不能在人类身上进行试验,临床的研究只是证明了VEGF、sFlt1、PIGF与子痫前期的相关性而不能证明其因果关系。一项巢式病例对照研究发现母亲循环中的sFlt1早在子痫前期症状发生前5周就已经开始升高,而PIGF在孕13-16周较对照组下降,表明sFlt1、PIGF是子痫前期诊断和预测的标志物。然而不是所有的子痫前期患者均表现为sFlt1的升高和VEGF、PIGF的降低,且导致这些血管生成因子不平衡的上游机制尚不明确。以上的局限性表明血管生成因子失平衡学说对于子痫前期的发病仍有未能回答的问题,暗示可能存在其他的胎盘因子参与子痫前期广泛的内皮功能障碍,仍需要更多的研究揭示sFlt1、VEGF、PIGF在子痫前期发病过程中的具体机制及导致其失平衡的起始因素。最近Kanasaki等在《自然》杂志发表的一篇文章引起人们的关注,作者提出儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)缺乏可能是子痫前期发病的启动因素。该研究发现COMT基因缺失的孕鼠出现子痫前期样临床及病理改变：早产、血压升高、尿蛋白升高等；胎盘出现类似人类蜕膜血管病变,且出现肾小球血管内皮病变。与野生型孕鼠相比,敲除COMT基因的孕鼠其胎盘缺氧诱导因子1a (HIF-1a)蛋白表达和血浆sFlt1浓度明显升高：而注射二甲氧雌二醇(2-ME)可使COMT基因缺失孕鼠子痫前期症状缓解,且无毒性。另外,2-ME可通过抑制HIF-1a的表达及sFlt1的升高改善胎盘缺氧状态。同时该研究发现人类妊娠晚期血浆2-ME水平上升,而重度子痫前期胎盘COMT及血浆2-ME水平下降。药理学实验也支持上述结果：正常孕鼠给予COMT抑制剂导致子痫前期症状发生,类似COMT基因缺失孕鼠症状,注射2-ME后孕鼠的血压及尿蛋白下降。此外,给予正常孕鼠注射2-ME前体拮抗剂使其发生子痫前期样改变。新近研究显示,2-ME协同低氧条件是妊娠过程中绒毛滋养细胞浸润生长和血管适度生成的重要条件。在低氧条件下,2-ME通过促进子宫胎盘循环建立,促进胎盘和胚胎的发育。以上研究提示来源于胎盘COMT的2-ME不仅保护血管内皮功能,还抑制HIF-1a及sFltl的表达；2-ME还可能是将来治疗子痫前期的有效天然药物。2-ME是体内17β雌二醇的天然代谢产物,在孕妇主要产生于胎盘。胎盘COMT是2-ME形成的关键限速酶。然而人类子痫前期胎盘COMT (?)(?)表达的初始原因是什么?有研究显示COMT基因第4外显子存在一个G>A的突变,导致酶的热不稳定性改变,致使COMT酶活性降低3-4倍。COMT此功能性单核苷酸多态性改变已被发现与多种疾病易感相关,在子宫内膜异位症、绝经时间、精神疾病、慢性疼痛等研究较多。其是否与子痫前期发病相关,目前尚无充分的研究支持。2研究的意义及目的综上所述,胎盘COMT(?)氏表达可能是导致子痫前期发病的启动因素,动物实验证实其导致2-ME低表达,进而调节血管生成因子、缺氧诱导因子1a的表达导致子痫前期的发生,理论上找到了血管生成因子失平衡所致的广泛血管内皮受损与胎盘机能不全的连接点。然而在人类身上的证据还相对缺乏,临床上关于COMT/2-ME与子痫前期关系的研究较少,且尚无胎盘COMT表达、血浆2-ME水平及胎盘COMT基因多态性的整体系列研究。因此本研究拟通过病例对照研究,(1)初步了解COMT在子痫前期组和正常对照组胎盘组织中的蛋白表达和mRNA表达的差异,分析胎盘COMT表达水平与子痫前期发病的关系及与病情严重程度的相关性；(2)了解胎盘COMT的产物2-ME在子痫前期组和对照组孕妇外周血浆中的水平,分析其与子痫前期的关系及与胎盘COMT表达的相关性；(3)研究胎盘COMT rs4680和rs6269两位点单核苷酸多态性与子痫前期的相关性,探讨胎盘COMT单核苷酸多态性与子痫前期发病的关系,为子痫前期发病及防治研究提供新的证据与思路,对降低其发病率、减少母婴并发症、降低孕产妇和围产儿死亡率有积极意义。第一章重度子痫前期胎盘组织COMT的表达[研究目的]通过荧光定量PCR及免疫组化技术检测重度子痫前期及健康孕妇胎盘组织中COMT的mRNA及蛋白表达水平,初步了解胎盘COMT表达与子痫前期的相关性,探讨胎盘COMT在子痫前期发病中的作用。[研究方法]1研究对象：本研究为病例对照研究,选择重度子痫前期组37例(其中早发型15例)及正常对照组40例(其中有30例孕周≥34周),重度子痫前期的诊断标准参考《妇产科学》(人民卫生出版社第七版教材,乐杰主编)。两组孕妇均为中国汉族妇女、单胎无畸形,且无慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病、肝病及其他内科合并症。2标本采集：胎盘娩出10min内,从胎盘母体面中央无菌剪取约0.5cm×0.5cm×0.5cm的胎盘绒毛组织(避开出血、坏死及钙化区域)3块,用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次,干纱布吸除水份,其中一块装入无菌无RNA/DNA酶冻存管,加入RNA保存液RNAlater1ml,4℃冰箱过夜后转入-20℃冰箱保存待提取RNA；另两块置入4%多聚甲醛中固定,用于免疫组化检测。3荧光定量PCR：提取胎盘组织总RNA,以RNA为模板,oligo dT为引物逆转录成cDNA,应用SYBGreen Ⅰ荧光染料技术,使用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪进行COMT及HIF-1a mRNA水平检测,磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作内参。4免疫组化：应用MaxVision一步法进行免疫组化实验,检测胎盘COMT蛋白定位及定量。5统计学分析：数据用SPSS13.0统计软件分析。计量资料结果用均数±标准差表示,采用两独立样本t检验。等级资料采用两独立样本非参数检验的Mann-WhitnerU秩和检验。相关性分析采用双变量相关分析或偏相关分析。所有的统计检验均为双侧概率检验,P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果]137例重度子痫前期组孕妇与40例正常对照组孕妇的年龄、孕周、体重指数(BMI)差异均无统计学意义,而新生儿出生体重、孕妇血清尿酸、平均动脉压(MAP)及尿蛋白差异有统计学意义。2胎盘COMT mRNA水平：重度子痫前期组胎盘组织COMT mRNA水平显著低于对照组(P<0.001)。进一步分组分析发现,早发型子痫前期胎盘COMT与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),晚发型子痫前期胎盘COMT mRNA水平显著低于对照组(P<0.001)。对照组中<34孕周胎盘组织COMT mRNA水平低于≥34孕周的,差异有统计学意义(P<0.05)。3胎盘COMT mRNA水平与临床指标相关性：控制孕周、年龄、体重指数作偏相关分析,COMT mRNA水平与血清尿酸水平、平均动脉压、24小时尿蛋白量均显著负相关(P均<0.05)。进一步分组分析发现晚发型子痫前期COMT mRNA水平与上述指标均显著密切负相关；而早发型子痫前期胎盘COMT mRNA水平与HIF-1a mRNA水平、血清尿酸水平、平均动脉压、24小时尿蛋白量均无显著相关性(P均>0.05)。4COMT蛋白表达：重度子痫前期组和对照组胎盘组织中均有COMT蛋白的表达,且表达部位一致,主要表达于绒毛滋养细胞胞浆中。半定量分析胎盘COMT蛋白表达发现重度子痫前期组与对照组表达强度有显著差异,以对照组较强(P=0.003)。进一步分组分析发现晚发型子痫前期胎盘COMT蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05),而早发型与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),对照组中<34孕周胎盘组织COMT蛋白水平低于≥34孕周的,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]1利用荧光定量PCR及免疫组化检测到重度子痫前期的胎盘COMT表达低于对照组,表明胎盘COMT与子痫前期相关,为子痫前期发病机制的研究提供新的思路与证据。2胎盘COMT表达水平与平均动脉压、血清尿酸及24小时尿蛋白量均具密切相关性,提示胎盘COMT表达可反映子痫前期病情严重程度。3正常孕妇<34周与≥34周胎盘的COMT mRNA及蛋白水平存在显著差异,其中≥34周胎盘的COMT表达水平较高,说明胎盘COMT在妊娠不同阶段表达不同。4早发型重度子痫前期胎盘COMT mRNA及蛋白水平与孕周匹配对照组相比无显著性差异,提示胎盘COMT在早发型重度子痫前期发病作用可能不同于晚发型重度子痫前期。第二章晚发重度子痫前期孕妇外周血浆2-ME的水平[研究目的]拟通过酶联免疫分析法检测存在COMT表达差异的晚发型子痫前期患者外周血浆2-ME水平,探讨其在子痫前期中的作用及与胎盘COMT表达的关系。[研究方法]1研究对象：第一章中的晚发型重度子痫前期患者22例及≥34周分娩的对照组30例。2标本采集：孕妇分娩前60分钟内用EDTA抗凝管取孕妇外周静脉血2ml,1000×g离心15min,取上层血浆置-80℃冰箱保存待测。3实验方法：按照2-ME EIA试剂盒说明书检测血浆2-ME水平。血浆检测前用β葡萄糖醛酸酶水解结合型的2-ME。结果采用试剂盒公司提供的软件自动分析。4统计学数据分析：数据用SPSS13.0统计软件分析。计量资料结果采用均数±标准差表示,采用两独立样本t检验比较两组差异。血浆2-ME水平与胎盘COMT mRNA水平及临床资料的关系采用双变量相关分析。[研究结果]1晚发型子痫前期与对照组比较,外周血浆2-ME水平无显著性差异(P=0.638)。2血浆2-ME水平与胎盘COMT mRNA水平、血清尿酸、24小时尿蛋白定量、平均动脉压均无显著相关性(P均>0.05)。[结论]1未能发现晚发重度子痫前期孕妇血浆的2-ME水平与对照组存在差异,说明血浆2-ME水平不适宜作为晚发重度子痫前期诊断指标。2重度子痫前期孕妇血浆2-ME水平与胎盘COMT mRNA水平之间无显著相关性,提示血浆2-ME水平可能受前体水平、细胞色素P450酶等综合因素的影响。3重度子痫前期孕妇血浆2-ME水平与血清尿酸、平均动脉压、24小时尿蛋白量均无显著相关性,说明其在妊娠晚期对子痫前期诊断及病情评估意义不大。第三章胎盘COMT基因多态性与子痫前期的关系[研究目的]应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测胎盘COMT rs4680和rs6269两个位点基因多态性,探讨胎盘COMT基因多态性与子痫前期的关系。[研究方法]1研究对象：子痫前期组92例(其中重度子痫前期37例为第一章患者,轻度子痫前期55例)。子痫前期的诊断标准参考《妇产科学》(人民卫生出版社第七版教材,乐杰主编)。正常对照组125例(其中40例为第一章对照组)。两组孕妇均为中国汉族妇女、单胎无畸形,且无慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病、肝病及其他内科合并症。2标本采集：同第一章留取胎盘组织提取RNA的方法。3实验方法：按照Trizol说明书提取胎盘组织DNA,紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度合格,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测COMT rs4680、rs6269基因型。4统计学数据分析：应用拟合优度x2检验判断两组各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。两组基因型分布频率及等位基因表型频率的比较,采用R×C列联表x2检验,并计算OR和95%置信区间,以P<0.05为差异有统计学意义。[研究结果]1Hardy-Weinberg平衡定律检验：子痫前期组和对照组胎盘COMT rs4680和rs6269位点的基因型频率分布经拟合优度x2检验,P值均>0.05,符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,表明本研究所选的样本代表性好。2两组胎盘COMT基因rs4680位点基因型频数分布无显著性差异(x2=0.142,P=0.931); G、A等位基因频数分布亦无显著性差异(x2=0.136,P=0.713)。3两组胎盘COMT基因rs6269位点基因型频数分布差异有统计学意义(P=0.019)；且等位基因G、A在病例组和对照组频数分布存在显著性差异(x2=6.382,P=0.012),OR=1.707(其中G为1.441,A为0.844),95%CI=1.125-2.590,表明G等位基因将增加子痫前期的患病风险,A等位基因则降低子痫前期患病风险。[结论]1应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在中国汉族人群首次检测胎盘COMT基因rs4680和rs6269位点多态性与子痫前期的关系,发现胎盘COMTrs6269多态性与子痫前期相关,且G等位基因增加患病风险。2胎盘COMT rs480基因分型分布在子痫前期组和对照组中未见差异。推测在汉族人群中胎盘COMT rs4680基因分型可能与子痫前期无关。全文结论1.利用荧光定量PCR及免疫组化检测到晚发型重度子痫前期的胎盘COMT表达低于对照组,表明胎盘COMT与晚发型重度子痫前期相关,为子痫前期发病机制的研究提供新的思路与证据。2.胎盘COMT表达水平与平均动脉压、血清尿酸及24小时尿蛋白量均具密切相关性,提示胎盘COMT表达可反映子痫前期病情严重程度。3.正常孕妇<34周与≥34周胎盘的COMT mRNA及蛋白水平存在显著差异,其中≥34周胎盘的COMT表达水平较高,说明胎盘COMT在妊娠不同阶段表达不同。4.早发型重度子痫前期胎盘COMT mRNA水平与孕周匹配对照组相比无显著性差异,提示胎盘COMT在早发型重度子痫前期发病作用可能不同于晚发型重度子痫前期。5.通过酶免疫分析法检测晚发重度子痫前期孕妇血浆的2-ME水平,未能发现其与对照组存在差异,且其与血清尿酸、平均动脉压、24小时尿蛋白量均无显著相关性,说明血浆2-ME对晚发型重度子痫前期的诊断及病情评估价值不大。6.重度子痫前期孕妇血浆2-ME水平与胎盘COMT mRNA水平之间无显著相关性,提示血浆2-ME水平可能受前体水平、细胞色素P450酶等综合因素的影响。7.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在中国汉族人群首次检测胎盘COMT基因rs4680和rs6269位点多态性与子痫前期的关系,发现胎盘COMTrs6269多态性与子痫前期相关,且G等位基因增加患病风险。8.胎盘COMT rs4680基因分型分布在子痫前期组和对照组中未见差异。推测胎盘COMT rs4680可能与中国汉族子痫前期无关。子痫前期病因复杂,发病机制可能涉及多因素、多环节。本研究从胎盘COMT mRNA及蛋白水平、孕妇血浆2-ME水平及胎盘COMT单核苷酸多态性多方位检测,探讨COMT与子痫前期发病的关系。结果显示胎盘COMT低表达与晚发重度子痫前期相关,且胎盘COMT低表达可能与其rs6269单核苷酸多态性相关。胎盘COMT表达水平可反映子痫前期的病情程度；而血浆2-ME与晚发子痫前期的关系尚不明确,不适宜作为诊断及反映晚发子痫前期病情严重程度的指标。